2020 Fiscal Year Annual Research Report
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19H03048
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
山本 洋嗣 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (10447592)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
Strussmann C.A. 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (10231052)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 環境依存型性決定機構 / 遺伝型性決定機構 / 環境ストレス / トウゴロウイワシ / TSD / amhy |
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| Outline of Annual Research Achievements |
魚類の性は「遺伝的要因」と「環境要因」の連続的バランスによって決定されるが、その共在の分子機構はほとんど未解明である。本研究は、「遺伝的性決定」と「環境依存的性決定」の２つの性決定機構の特徴を完全に併せ持つモデル魚を用い、その共在機構の全容解明を目指すものである。本年度はトウゴロウイワシ目魚類ペヘレイを用い、課題１「性決定に与える種々の環境要因の影響調査」、課題２「性決定遺伝子および性決定関連遺伝子の発現制御機構の解明」、課題３「ゲノム編集技術を用いた遺伝的性決定因子の機能破壊と環境依存型性決定機構への影響調査」に取り組んだ。課題１では環境要因として、塩分が本種性決定に与える影響を調査した。その結果、高塩分により、コルチゾールおよび11-ketotestosterone（11-KT)が上昇することで雄化が促進される可能性が示唆された。課題２では、雌化の鍵となるcyp19a1aのプロモーター領域を単離し、レポーターアッセイのためのコンストラクトを作成した。さらに、培養細胞（魚類表皮細胞株）を用いたレポーターアッセイを行い、cyp19a1a遺伝子の発現制御機構を調査したところ、cortisolがcyp19a1a発現を促進させる可能性が示唆された。課題３では、昨年度に確立したゲノム編集技術（CRISPR-Cas9）により、ペヘレイの遺伝的および温度依存的性決定の共在の鍵であると考えられるamhyおよびamhaの遺伝子の機能破壊をそれぞれ試みた。amhyおよびamha遺伝子にそれぞれ変異が導入された個体を得ることができたため、表現型性の調査のため現在継続飼育をしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は予定していた３つの研究課題、（１） 性決定に与える種々の環境要因の影響調査、（２）性決定遺伝子および性決定関連遺伝子の発現制御機構の解明、（３）ゲノム編集技術を用いた遺伝的性決定因子の機能破壊と環境依存型性決定機構への影響調査、を開始した。（１）に関しては、環境要因として、塩分がペヘレイ性決定へ与える影響を調査するための飼育試験を行った。その結果、高塩分飼育によりコルチゾール-11KT系を介した雄化が誘導される可能性を示した。（２）に関しては、雌化の鍵となるアロマターゼ遺伝子cyp19a1aのプロモーター領域を組み込んだコンストラクトを作成し、魚類表皮細胞由来の培養細胞を用いてレポーターアッセイを行い、コルチゾールがcyp19a1a遺伝子発現を促進させる可能性を示した。（３）に関しては、ペヘレイにおいて遺伝型性決定の鍵となると予想されるamhyおよび温度依存型性決定の鍵となると予想されるamha遺伝子を標的に機能破壊実験を行なった。それぞれの遺伝子に変異が導入された個体を得ることができたため、現在、表現型性および性の水温感受性を調査するため飼育試験を行なっている。以上、予定していた3課題について概ね計画通り着手できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度も引き続き、（１） 性決定に与える種々の環境要因の影響調査、（２）性決定遺伝子および性決定関連遺伝子の発現制御機構の解明、（３）ゲノム編集技術を用いた遺伝的性決定因子の機能破壊と環境依存型性決定機構への影響調査の３課題の追試験および再現性確認実験に取り組み、これらに加えて（４）遺伝的 vs 環境依存的性決定機構におけるBPG軸の発現遺伝子の網羅的解析に着手する。課題１では、環境要因として日長に着目し、本要因がペヘレイの性決定機構にどのような影響を与えるのかを明らかにするため、異なる日長条件下で孵化直後の稚魚を用いた飼育試験を開始し、定期的に採取したサンプルを用いて内分泌学的、分子生物学的視点から複合的に日長条件と性の関係性を調査する。課題２では、昨年度までに作成したamhy、amhaおよびcyp19a1aの各プロモーター領域を組み込んだコンストラクトおよび魚類細胞由来の培養細胞を用いたレポーターアッセイを行い、これまで明らかになっている各種転写制御因子の強度と転写制御部位の特定に取り組む。課題３では、amhyおよびamha遺伝子を破壊できたと思われる個体数が未だ少なく、各遺伝子と性の水温感受性の関連調査が困難であるため、継続してのamhy およびamha遺伝子を標的とした機能破壊実験を行うとともに、変異導入個体の水温別飼育試験を行い、各遺伝子の機能と性の水温感受性の関連を調査する。さらに、課題４として、ペヘレイの性決定機構をより広く理解するため、性決定時期の高温下で飼育したXX雄(偽雄)と通常XY雄、および低温下で飼育したXY雌(偽雌)と通常XX雌 から脳を摘出し、次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を行い、発現遺伝子の網羅的比較解析を行う。
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Research Products
(4 results)
