2019 Fiscal Year Annual Research Report
低炭素社会構築に向けた低温適応性新規糖質分解酵素の高機能化とその利用
| Project/Area Number |
19H03090
|
|---|
| Research Institution | Osaka Prefecture University |
|---|
Principal Investigator |
上田 光宏 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (50254438)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉田 太郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (50391248)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 低温適応性糖質分解酵素 / 生デンプン分解酵素 / セルラーゼ / 低炭素社会構築 / バイオ燃料 / 連続糖化発酵法 / ミミズ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに低炭素社会構築に向けてミミズ由来の低温適応性新規糖質分解酵素の構造と機能に関する研究を行ってきた．ミミズ由来の生デンプン分解酵素は低温環境下でも糖化能力を維持する酵素である，そこで，ミミズ由来の2種の生デンプン分解酵素（Ef-AmyIとEf-AmyII)の高機能化を目指して構造機能相関に関する研究を行った．Ef-AmyIとEf-AmyIIとは89％のアミノ酸配列の相同性を有するが，基質特異性や分解様式に違いが認められる．この違いは11％の僅かな相同性の違いから引き起こされる構造の違いが原因であると考えた．Ef-AmyIとEf-AmyIIの結晶構造解析から活性部位付近にEf-AmyIのみにグリシンリッチループが存在する事を見出した．このループ構造が酵素の性質に違いをもたらしていると予測した．Ef-AmyIからグリシンリッチループを削除した変異酵素（Ef-AmyIΔloop)を作製した．その結果，Ef-AmyIΔloopは可溶性デンプンや不溶性デンプンや重合度5のマルトペンタオースに対する比活性はEf-AmyIとほとんど変わらなかった．しかしながら重合度４以下のオリゴ糖に関しては比活性に差が見られた．これよりloop構造はG4以下のオリゴ糖分解に影響を与えることが明らかとなった．さらにオリゴ糖を用いて分解産物を調べたところ，Ef-AmyIとEf-AmyIIとで分解産物に差が見られた．AmyIはG4からメインの分解産物としてG2を産出したが，AmyIIではG4からG3,G2, G1がほぼ同濃度得られた．Ef-AmyIΔloopではAmyIと比較して分解産物がG2だけでなく他の分解産物も検出され，ばらつきが見られた．これより，グリシンリッチループはオリゴ糖の分解活性及び分解様式に影響を与えていることが明らかとなった．用途に応じて両酵素を使い分けることで，様々な重合度のオリゴ糖の調製が可能と考えている．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度，低炭素社会構築に向けてミミズ由来の低温適応性新規糖質分解酵素の高機能化とその利用に関する研究を行ってきた．低温適応性生デンプン分解酵素であるEf-AmyIとEf-AmyIIのアミノ酸配列の僅かな違いが基質特異性や分解様式に差をもたらすと考え，構造面並びに機能面からそれぞれ検討した．その結果，Ef-AmyIにのみに存在するLoop構造がオリゴ糖の分解活性や分解様式に影響を与えていることを明らかにした．さらに，現在，Ef-AmyIとEf-AmyIIの構造比較から2カ所部分で構造が異なっていることを明らかにしている．生デンプンを低温下で効率よく分解するためにもこれら2種類の酵素の構造機能相関を明らかにすることは重要と考えている．各種変異酵素も作成中でおおむね順調に進展している．他の糖質分解酵素に関しても，低温活性の向上とともに，熱に対する安定性を保持した酵素を得るために各種変異酵素を作製中である．
|
| Strategy for Future Research Activity |
・低温適応性生デンプン分解酵素（Ef-AmyI, Ef-AmyII) に関して
低温適応性生デンプン分解酵素であるEf-AmyIとEf-AmyIIのアミノ酸配列の僅かな違いが基質特異性や分解様式に差をもたらすと考え，構造面並びに機能面からそれぞれ検討してきた．これまでに，Ef-AmyIにのみに存在するLoop構造がオリゴ糖の分解活性や分解様式に影響を与えていることを明らかにした．今後は，以下の点に関して研究を推進する．不溶性多糖を加水分解できる酵素には，一般に糖質吸着ドメインを有している．Ef-AmyIとEf-AmyIIとも不溶性の生デンプンを分解できるが，2つの酵素とも糖質吸着ドメインを有していない．不溶性デンプンに対する吸着能はEf-AmyIよりEf-AmyIIの方が高い吸着性を有している．そこで，Ef-AmyIとEf-AmyIIのアミノ酸配列の違いから，デンプン吸着に関与する領域を調べた．その結果，Ef-AmyIIにのみに吸着に関与する可能性にあるアミノ酸残基(デンプン結合部位：Surface binding site)が存在することを見出した．現在，変異酵素を作製し，デンプン吸着に関与するアミノ酸なのかどうかを確認している．今後は，デンプン結合部位の機能を明らかにする予定である．さらに，デンプン吸着に必要なアミノ酸を挿入した変異酵素を作製し，低温下での糖質分解への利用を測る．
・その他の低温適応性糖質分解酵素に関して
ミミズ由来の組換えセルラーゼやマンナナーゼをはじめとする他の糖質分解酵素においては，より低温側での活性の向上や温度に対する安定性の向上を目指して各種変異酵素を作製し，その効果を確かめる．
|
-
-
-
-
-
-
[Presentation] ヒラタケ属(Pleurotus sp.)由来酸性トレハラーゼの精製及びクローニング2019
Author(s)
堤楽, 中澤昌美, 阪本龍司, 楠田瑞穂, 石川真梨子, 原田慎嗣, 小林仁, 大内謙二, 稲冨聡, 坂口実, 上田光宏
Organizer
日本生化学会大会
-
-
-
-
