2020 Fiscal Year Annual Research Report
骨格筋肥大・萎縮の根幹である筋原線維構造の形成・維持・分解メカニズムの解明
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19H03100
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
西邑 隆徳 北海道大学, 農学研究院, 教授 (10237729)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾嶋 孝一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 上級研究員 (60415544)
鈴木 貴弘 北海道大学, 農学研究院, 助教 (80750877)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨格筋 / 筋原線維 / 太いフィラメント / ミオシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、骨格筋の肥大・萎縮メカニズムの解明を目的に、筋原線維における太いフィラメントの形成、維持および分解機構を追究する。今年度は、筋原線維内の太いフィラメントにおけるミオシン分子の置換機構を明らかにするために、ミオシン関連ユビキチンリガーゼが太いフィラメントにおけるミオシン分子の置換に及ぼす影響を検討した。また、太いフィラメントにおけるミオシン分子の挿入・解離の局所性についても調べた。
速筋型（GFP-Myh1）、遅筋型（GFP-Myh7）あるいは胚型（GFP-Myh3）のミオシン分子とmCherry-Ozzを共発現する筋管を用いてGFPの光退色蛍光回復法で調べた結果、Ozz過剰発現下におけるGFP-Myh1およびGFP-Myh7の蛍光回復は、Ozzを過剰発現していない対照区と同程度であった。しかし、GFP-Myh3の蛍光回復は対照区よりも有意に抑制された。また、mCherry-Ozzは細胞質画分には存在せず、筋原線維画分にのみ存在した。Ozzの過剰発現がGFP-Myh3の置換を特異的に抑制したことから、筋原線維における胚型ミオシンの置換にユビキチンリガーゼが関与することが示唆された。
次に、Halo-Myh3発現筋管を用いて新規合成ミオシンの蛍光パルスチェイスを行った結果、挿入されたミオシン分子の局在を示す蛍光ピークは、パルスチェイス7分後には太いフィラメントの両端に認められ、30分後には中央に接近した。また、新規合成ミオシン分子の非標識条件下においても蛍光回復が観察されたことから、太いフィラメントから一度解離したミオシン分子も再度挿入されることが示された。ミオシン分子の再組み込みもA帯端から起こる傾向が見られた。以上の結果は、筋原線維の太いフィラメントにおけるミオシン分子の置換は両端で起こりやすいことを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の全体計画では、筋原線維における太いフィラメントの形成、維持および分解機構を追究することにしている。昨年度までの本研究によって、1）筋原線維における太いフィラメントを構成するミオシンは分子単位で置き換わること、2）筋原線維内のミオシン分子は新規合成および細胞質のミオシン分子と置換すること、3）分子シャペロンの熱ショックプロテイン（Hsp90）はミオシンの置換を促進することなどを明らかにした。
しかし、筋原線維内の太いフィラメントにおけるミオシン分子の置換がどのように調節されているかは未解明であった。そこで、今年度は、タンパク質分解系が太いフィラメントにおけるミオシン分子の置換にどのように関与しているか、さらに、太いフィラメントにおけるミオシン分子置換の局所性について検討した。その結果、筋細胞におけるOzzの過剰発現はユビキチン化と分解促進を通してミオシン分子の置換を減少させることを明らかにすることができた。また、太いフィラメントから一度解離したミオシン分子も再度筋原線維に組み込まれること、筋原線維の太いフィラメントにおけるミオシン分子の置換は両端で起こりやすいことも発見した。以上のように、本研究は概ね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究では、筋原線維の維持機構を解明するため、ミオシンアイソフォーム特異的な修飾が、細胞質におけるミオシンの溶解性および太いフィラメントへの挿入に及ぼす影響を検討する。具体的には以下の3点を検討する。
1. 太いフィラメントを形成するミオシン分子は最終的にユビキチンプロテアソームシステムで分解される。培養骨格筋細胞から筋原線維画分および細胞質画分を調製し、免疫沈降とイムノブロットの組合せることで、どちらの画分にユビキチン化ミオシン分子の割合が多いのかを調べる。また、ミオシン重鎖特異的にユビキチン付加するユビキチンリガーゼが存在する画分を明らかにする。
2. 加齢により筋線維は合成・分解のアンバランスにより萎縮が起きるが、遅筋型に比べて速筋型筋線維で萎縮が大きいことが報告されている。本研究では、加齢がミオシン分子の置換に及ぼす影響を検討するために、2か月〜2年齢のGFP-Myh7およびKusabiraOrange-Myh1ノックインマウスから単離した遅筋型および速筋型筋線維を用いてFRAPを行う。
3.新規合成されたミオシン分子が筋原線維の太いフィラメントにどのように組み込まれるかを明らかにするために、筋原線維を形成しているミオシン分子を緑色蛍光で、新規合成ミオシン分子を赤色蛍光で標識し、ミオシン分子の動態を共焦点レーザー顕微鏡で観察する。
以上の実験で得られた結果を取り纏め、日本畜産学会、日本獣医学会およびアメリカ細胞生物学会で成果発表する予定である。
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