2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a new strategy aiming for the prevention of animal infections using antimicrobial proteins and peptides
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19H03101
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
米山 裕 東北大学, 農学研究科, 教授 (10220774)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野地 智法 東北大学, 農学研究科, 教授 (10708001)
伊藤 幸博 東北大学, 農学研究科, 准教授 (70280576)
榎本 賢 東北大学, 農学研究科, 准教授 (90546342)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗菌ペプチド / 抗菌タンパク質 / 細菌感染症 / 抗生物質 / 薬剤耐性菌 / 家畜感染症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
家畜生産現場で頻発する牛乳房炎は罹患しやすく極めて治りにくい疾病のため世界的に家畜の最難治疾病の一つとされ、その経済的損失は甚大である。乳房炎の治療法として抗生物質投与が一般的であるが、起因菌の中でも黄色ブドウ球菌は抗生物質投与によって一旦治癒しても再発を繰り返し根治することが困難である。一方、近代の集約的家畜生産システムは治療とは別に飼料に低濃度添加する抗生物質に依存しており、それが選択圧として作用し薬剤耐性菌出現の温床となりうることから公衆衛生上大きな問題となっている。本研究では抗生物質に代わる家畜感染症の新規防除戦略の開発を目指し、２つの研究課題に取り組み以下の結果を得た。1)ランダムな7ペプチドからなるファージライブラリーを用い前年度に選抜した候補ヘプタペプチドは標的である黄色ブドウ球菌に対する特異性が期待するほど高くないことが分かった。そこで、ランダムな12ペプチドファージライブラリーを用い、パニング操作条件を検討し選抜した結果、標的としたSA5株への結合能が高い候補ドデカペプチド3種類の取得に成功した。2)昨年度取得したイネのRAmy3A分泌シグナルを付加した組換え型遺伝子を導入した再分化個体の破砕試料のタンパク質レベルでのリゾスタフィン発現を評価したが検出することはできなかったので、イネRAmy3D分泌シグナルを用いた組換え型遺伝子を導入したイネを取得した。3)この形質転換イネでのリゾスタフィン発現をウェスタンブロット解析した結果、カルス破砕試料中にリゾスタフィンタンパク質の発現が認められた。4)リゾスタフィンの安定性に及ぼす宿主であるイネ（日本晴）培養液の影響を検証するために、市販リゾスタフィンと日本晴植え継ぎ12日後の培養液を混合し28℃、3日間保温した結果、リゾスタフィンの分解が認められ、リゾスタフィン不安定化の要因としてプロテアーゼの関与が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では次の２つの課題を実施している。①ファージディスプレー法を用いて乳房炎由来黄色ブドウ球菌に対して特異的結合能をもつペプチドの探索を行い、抗生物質に代わるミサイル療法の確立に向けた基盤研究を行う。②黄色ブドウ球菌を特異的に殺菌する抗菌タンパク質リゾスタフィンを用いた新規乳房炎防除法を開発するためには抗菌タンパク質の極めて安価な生産法の確立が必須である。そこで、本研究において植物を宿主としたリゾスタフィンの極めて安価な生産法の確立を目指す。
課題①に関して、ランダムな12ペプチドからなるペプチドライブラリーを用いたファージディスプレイ法を用いた選抜を実施し、前年度のヘプタペプチド候補よりも標的である黄色ブドウ球菌SA5株に対する特異性の高い候補ドデカペプチド3種類の取得に成功した。しかし、この候補ペプチドと抗生物質との複合化合物を合成してミサイル療法のツール開発を実施する前提として、さらなる標的への高い結合特性の検証が必要である。
課題②に関しては、イネのアミラーゼRAmy3Dのシグナル配列を新たにリゾスタフィンN末端に付加した組換え型遺伝子を導入したイネ形質転換体の取得に成功し、培養カルスの細胞破砕試料におけるリゾスタフィンの発現がウェスタンブロット解析で検証できた。しかし、目標としている培養上清中へのリゾスタフィンの分泌は現時点では認められておらず、市販リゾスタフィンの安定性に対する検討を行った結果、宿主（日本晴）イネの培養液中に存在するタンパク質分解酵素の関与が示唆された。このことから、形質転換イネによる組換え型リゾスタフィンの生産性の改善を図るために、今後、リゾスタフィンの安定性に寄与するイネ固有のタンパク質分解酵素等、分解に関係する因子の詳細な検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題①について、12ペプチドからなる黄色ブドウ球菌SA5株に対する特異的結合能をもつ候補ドデカペプチドが3種類取得できたので、選択的結合能に関する詳細な検証を行うために、原理の異なる次の結合アッセイを実施する。1)候補ドデカペプチドのC末端に蛍光試薬を標識したプローブペプチドを化学合成し、それらのプローブペプチドの各種被検菌に対する結合能を検証する。2)候補ドデカペプチドを発現するM13ファージの各種被検菌に対する結合能を、M13ファージに対する抗体をプローブとして評価する。3)現時点で得られている3種類の候補ドデカペプチドがミサイル療法のツールとして妥当か不明であることから、これら3種のドデカペプチドよりも、さらに黄色ブドウ球菌に対する選択性の高い候補ペプチドの探索を進める予定である。
課題②については、リゾスタフィンの安定性に関与することが想定される因子としてプロテアーゼが示唆された。そこで、この仮説を検証するために以下の検討を行う。1)イネゲノム情報を検索しイネがもつプロテアーゼ遺伝子を抽出し、それらのプロテアーゼ遺伝子がノックアウトされている誘導体ライブラリーの中から、分泌型のプロテアーゼ遺伝子が破壊されているイネ誘導体を選抜する。2)それらの分泌型プロテアーゼ遺伝子破壊イネの細胞培養液の市販リゾスタフィンに対する分解活性を評価する。3)リゾスタフィンを基質として分解することが同定されたプロテアーゼ遺伝子を欠損したイネ誘導体に組換え型リゾスタフィン遺伝子を導入した形質転換体を作出し、リゾスタフィンの生産性に及ぼす影響を検討する。4)イネアミラーゼRAmy3Dのシグナル配列を付加した組換え型リゾスタフィンは、少なくとも培養カルスの細胞破砕試料でタンパク質レベルの発現が確認できたので、その試料の抗菌活性の検証を行う。
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