2019 Fiscal Year Annual Research Report
Osteochondral regeneration by autologous transplantation of abundant stem cells cultured high-densely
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19H03129
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Research Institution | Kagoshima University |
Principal Investigator |
三角 一浩 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (10291551)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藏元 智英 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 助教 (80813154)
畠添 孝 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (90776874)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | 幹細胞 / 軟骨 / 骨 / 関節症 / 再生医療 |
Outline of Annual Research Achievements |
馬の滑膜由来幹細胞を最少継代(1継代)で大量(1×10^9個)に培養する技術を確立するために以下の3つの実験を行った。 ①変形性関節症のある馬の手術時に得た滑膜組織を用いて間葉系幹細胞を分離し、通常の二次元培養を行った。滑膜(400mg)から抽出された間葉系幹細胞は培養8日目に5.85×10^6を得た。 ②滑膜組織から分離培養した間葉系幹細胞を用いて、不織布による三次元培養の条件についてスモールスケールで検討を行った。不織布に接着した滑膜幹細胞をクリスタルバイオレットで染色し、不織布からの剥離・回収した結果、不織布1枚あたり1×10^5 以上の滑膜幹細胞が接着できることを確認した。培養開始時の播種密度と培養期間をスモールスケールで検討した。細胞増殖は、培地中のグルコース消費量からモニターした。播種密度を不織布1枚あたり1×10^4で培養開始すると、培養液中のグルコース消費量が6日目から増加し始め、10日後には平坦化した。11日目に細胞を回収すると、不織布1枚あたり3×10^5個(播種密度の30倍)に達した。 ③変形性関節症例から得た滑膜組織から抽出した細胞を、直接不織布に播種して、三次元高密度大量培養する条件を検討した。自動培養装置を設定して、培地300mlに不織布300枚を入れ、1枚あたり1×10^4個(総数3×10^6個)の細胞を播種し、培養を開始した。グルコース消費量が4~7日目で増加し、その後平坦化したため、10日目で細胞の剥離を行った。不織布1枚あたり4.8×10^5個(播種数の約50倍、総数1.45×10^8個)を得た。細胞の表面抗原と多分化能を評価し、CD44及びCD90陽性、CD34陰性の幹細胞としての特性を確認した。 三次元高密度大量培養システムによって滑膜組織由来の幹細胞を大量培養して、10日間で1×10^8 個以上の細胞を得るという目標が達成できた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
馬の滑膜由来幹細胞を最少継代(1継代)で大量(1×10^9個)に培養する技術を確立することが本研究の前半部分の目標である。今年度は、滑膜間葉系幹細胞の三次元高密度大量培養の条件を設定した。変形性関節症例から得た滑膜組織から抽出された細胞を、直接不織布に播種して、大量培養する条件を検討した。自動培養装置を動物細胞仕様に設定して、培地300mlに不織布300枚を入れ、1枚あたり1×10^4個(総数3×10^6個)の細胞を播種し、培養を開始した。グルコース消費量は4~7日目で増加し、その後平坦化したため、10日目で細胞の剥離を行った。その結果、不織布1枚あたり4.8×10^5個(播種数の約50倍、総数1.45×10^8個)を得ることができた。それら細胞について、表面抗原と多分化能を評価し、CD44とCD90陽性、CD34陰性という、間葉系幹細胞としての特性が確認された。三次元高密度大量培養システムを用いることによって、手術中の滑膜組織から分離した滑膜幹細胞を大量培養して、10日間で1×10^8 個(1億個)以上の細胞を得るという初年度の目標を達成することができた。
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Strategy for Future Research Activity |
手術によって得た滑膜細胞から10日間で1億個以上に増やすことが可能となったことから、次のステップとして、拡大培養して、幹細胞としての機能を保ったまま1継代で1×10^9個(10億個)に達する技術を確立する。実験馬4頭(手根関節に変形性関節症のある馬が望ましい)を用意し、関節鏡視下で採取した滑膜組織から分離した間葉系幹細胞を、三次元高密度大量培養システムを用いて大量培養し、骨軟骨欠損のある橈骨手根骨間関節内に自家移植して、経過観察と最終の病理学的評価により安全性と効果を判定する。 具体的に、関節鏡視下にて両側の橈骨遠位端に直径5mm×深さ5mm の骨軟骨欠損を形成すると共に、両側の手根骨間関節から滑膜組織(1,000mg)を採取する。三次元高密度大量培養システムを用いて、1×10^9 個以上の滑膜幹細胞を得る。術後2、4、6,8週間後に1×10^8 個の滑膜幹細胞浮遊液を関節内注射により自家移植する。注射後の合併症の有無を観察し、10週後に関節鏡検査を行って骨軟骨欠損の修復について肉眼的に評価した後、骨軟骨欠損孔のX 線CT、MRI、及び病理組織検査を実施する。CT画像は、専用の画像解析ソフトを用いて、骨欠損部容積を算出し、術後の容積縮小率を移植孔と対照孔で比較することで、幹細胞移植の骨再生効果を客観的に評価する。MR 検査では、正常な関節軟骨に見られる表層軟骨と深層軟骨の信号強度の相違パターンから本来の関節軟骨構造の再生を評価する。骨軟骨欠損部の表面を肉眼的に観察した後、欠損孔の矢状断を比較評価する。脱灰標本を作製して、マッソントリクローム染色により、欠損孔内の線維性肉芽組織及び線維軟骨を区別し、軟骨下骨における骨梁構造の再生についてスコア化する。細胞外基質であるⅡ型コラーゲンの免疫染色やプロテオグリカンのサフラニンO 染色によって、硝子軟骨の再生を評価する。
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