2019 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of new gene modified moue production system
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19H03142
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
水野 聖哉 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (10633141)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤山 知之 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (00635089)
久野 朗広 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60830122)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / モデル動物作製 / Cre-LoxP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では3つの研究課題に取り組んでいる。以下に令和元年度における各研究の実績を記載する。
1)ゲノム編集遺伝子変異の網羅的解析法の確立: マウス受精卵でのゲノム編集では様々な種類の変異を誘導できる。特に2箇所を同時切断することで誘導できる標的配列欠損変異やFlox変異をもつ遺伝子改変マウスは有用が高い。しかし、2箇所を同時切断した場合には目的とする変異以外も誘導され、それらが混在するマウスが誕生する。この変異アレルを一度に全て検出するための新規次世代シークエンス法を開発し、バーコードPCRにより50以上の多検体を一度に処理できること、各変異アレルの検出とその分類に成功した。
2)新規Creノックインマウスの作製: Cre-LoxPシステムを基盤とする条件付きノックアウト(cKO)マウスは標的遺伝子の機能を特定の時期・組織で解析することができる。この際、組織・時期特異性はCreの発現制御系に依存する。高精度にCreの発現が制御されたマウスを作出するために、組織特異的な発現を示す遺伝子座にCre遺伝子をノックインしたマウスの作出を実施した。我々が作出した生殖細胞で特異的に発現するDdx4遺伝子座にCreERT2遺伝子をノックインしたマウスでは、タモキシフェンの投与によりオス・メスともに100%の効率でCre-LoxP組換えが誘導できた。その一方で、生殖支持細胞での組換えを期待して作出したCyp19a1-Creノックインマウスでは、標的細胞での組換え効率が悪く、また、非特異的な組換えも観察された。
3) 標的遺伝子座への高頻度変異マウス作出法の確立: 標的遺伝子座を高頻度にゲノム編集するために、あるゲノム編集エフェクターを発現するマウスを作製した。また、そのエフェクターを発現する細胞だけを抽出する系を確立ためのベクター構築を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた遺伝子改変マウスが順調に進んだために、全3課題ともおおむね順調に進展している。特に課題1はDNA解析ソフトウェアの開発が当初に予想を超えた速度で実施できている。一方で課題2では、デザイン通りのCre発現が生じない系統が出現したために、やや遅れた進展となった。課題3では作出の難しい長鎖ノックインマウスが順調に作出できているために、おおむね順調に進展している。これらのまとめると、平均的には、十分に予想通りに進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
各研究課題の今後の推進方策をいかに示す。
1)ゲノム編集遺伝子変異の網羅的解析法の確立: 令和元年度の研究で、2cutゲノム編集アレルの解析系の大枠を確立することができた。そこで令和2年度はそれ以外のゲノム編集変異の解析系の樹立を目指す。また、予期せぬ変異の検出や3つ以上の変異アレルを有するモザイク個体の自動判別系の確立も目指す。更に、本技術を一般に広く使用してもうらことを目的として、使用しやすいユーザーインターフェースも開発する。
2)新規Creノックインマウスの作製: 令和元年度に引き続き、Creノックインマウス系統の作出を行う。令和元年度の作出したCyp19a1-Creマウスは、予想に反して、生殖補助細胞での組換え効率が低かったので、他の遺伝子についても検討する。更に、卵母細胞の各卵胞ステージのCre driverマウスの作出も目指す。作出した新規系統は、我々が保持するCreレポーターマウスと交配し、その組換え効率と組織特異性を確認する。
3)標的遺伝子座への高頻度変異マウス作出法の確立: 新規ゲノム編集ツールを超高効率に受精卵ゲノムへと導入することを目指す。その外来性遺伝子の導入時期と濃度条件の検討を詳細に行っていく予定である。また、非常に多くのバリエーションを有するゲノム編集変異遺伝子を個々に特定し、その割合と分布を解析する系を1)の研究課題で培った技術を生かして、開発していく。さらに、2)で開発したCreマウスとも組み合わせることで特定の組織・時期でのみ変異を持った遺伝子を発現する系についても開発していく予定である。
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Research Products
(3 results)
