2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19H03143
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
堀居 拓郎 群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (00361387)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 純代 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (40589264)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 単為発生 / エピゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの動物は受精を経ず卵子だけから個体発生する単為発生を生殖戦略の１つとして採用してきた。一方、哺乳類の単為発生胚は発生途中で致死となる。これは、哺乳類だけが配偶子特異的な遺伝子修飾「ゲノムインプリンティング」を保有するためである。近年では、遺伝子工学と発生工学を駆使して、ゲノムインプリンティングを操作することにより、単為発生マウスを得られるようになった。しかし、インプリント遺伝子の発現調節領域のゲノムの改変が必要なことや、発生段階の異なる卵子を準備して一連の核移植操作を行なう必要があるなどマウス以外の哺乳類には適用が難しいものであった。本研究では、我々が最近開発した高効率エピゲノム編集法（Nature Biotechnology, 2016）により、ゲノムを一切改変することなく、遺伝子修飾のみを書き換えることによって卵子から単為発生マウスの作製を試みる。
これまでの申請者らの研究から、単為発生胚よりも単為発生胚由来ES細胞の方が、母性インプリントが消失して正常胚に近い状態であることがわかっている。そこで単為発生胚由来ES細胞（PgES）をエピゲノム編集して個体作製を試みた。単為発生胚に不足する父性インプリントは、Igf2/H19を補うだけでも効果があり、加えてDlk1/Gtl2を補うことで十分効果があることが示唆されている（Kawahara et al., 2007）。マウス未受精卵よりES細胞を樹立し、まずはエピゲノム編集用複合体（H19-DMR、dCas9-Suntag、scFv-GFP-Dnmt3bの発現ベクター）をトランスフェクションし、H19-DMRのみにメチル化を導入した。エピゲノム編集されたPgES由来個体を４倍体補完法により作製した。通常、単為発生胚は妊娠9.5日目で死亡するが、妊娠13.5日目で帝王切開したところ、胎児形成を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H19-DMRのエピゲノム編集によりPgESのH19-DMRのメチル化を書き換えることができた。また、４倍体胚盤胞にエピゲノム編集したPgESを導入することで、少なくとも13.5dpcまで発生が延長することを確認することができたため、この進捗状況とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までにH19-DMRのエピゲノム編集により、単為発生胚の発生が少なくとも13.5dpcまで延長することを確認できている。一方、胎児形成率は約3%と非常に低いことが明らかとなった。胎児形成率改善のため、次年度はH19-DMRおよびGtl2-DMRの両方をエピゲノム編集したPgESを樹立し、４倍体補完法により個体形成率を確認する。また、得られた個体のDNAメチル化状態をCOBRA法およびバイサルファイトシーケンス解析により確認する。
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[Book] 遺伝子医学2019
Author(s)
堀居拓郎、森田純代、畑田出穂
Total Pages
168
Publisher
メディカル ドゥ
ISBN
978-4-909508-05-8
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