2021 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of platform for new gene-modified models using golden hamsters
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19H03151
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
小倉 淳郎 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 室長 (20194524)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゴールデンハムスター / 遺伝子ノックアウト / 疾患モデル動物 / 受精 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、多産、容易な飼育・繁殖、マウスよりも早い世代交代などを特長とするゴールデンハムスターに着目し、マウスで未解明の遺伝子のCRISPR/Cas9 KOおよびノックイン（KI）モデルの作出を試みることにある。また、得られた改変動物系統を保存するための信頼性の高い胚凍結保存法も開発する。本年度も引き続き、１）ハムスターノックアウト（KO）技術の効率化および２）ハムスター胚の凍結保存技術の開発を行なった。
１）ハムスターKO技術の効率化では、in vivo 卵管内 electroporation であるGONAD法の実験条件の適切化を行った。これまで、GONAD 後の出生率が低いことが明らかとなったので、day 1 の卵管内の卵子を検索したところ、多くの場合で未受精卵であることがわかった。昨年度は過排卵用のPMSGの注射の dose を下げることによって、妊娠率の向上に成功したが、本年はさらに、抗インヒビン血清と eCG (equine chorionic gonadotrophin) の1:1 混合液を Day 1 に注射することにより、妊娠率と出産数の向上に成功した。
２）ハムスター胚の凍結保存技術の開発では、昨年度に引き続き、自然交配3日後の8-16細胞期胚を子宮灌流により採取し、凍結保存を行った。偽妊娠雌に移植すると、妊娠が生じない場合が多いため、妊娠雌へ移植する技術を開発した。さらに本年度は新たに、精子凍結法の開発を開始した。その結果、これまでほぼ0%であった凍結融解後の精子生存率が、10－20％程度まで上昇した。今後、これらの精子を使って、人工授精を実施する予定である。これにより、ゲノム編集ハムスター系統が凍結保存できるものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、ノックアウトゴールデンハムスターの作出とこれらの系統保存技術の確立にある。これまでに9系統のノックアウトハムスターの作出に成功した。また、Mov10l1 ノックアウトハムスターの解析が完了し、雌雄とも不妊になることを確認した。これは期待通り、マウスとは異なる表現型であり、Nature Cell Biology誌に報告することができた。また、昨年度に、COVID-19のモデルとして作出した、糖尿病を発症することが期待される Irs2遺伝子のノックアウトハムスターは系統として確立しつつあり、ホモノックアウトは体重が少ない傾向が見られた。今後、糖尿病の発症の有無について検討を行う。凍結保存技術については、妊娠雌への胚移植法が確立できた。一方、本年度は新たに、精子凍結法の開発を開始し、これまでほぼ0%であった凍結融解後の精子生存率が、10－20％程度まで上昇した。今後、これらの精子を使って、人工授精を実施する予定である。以上より、おおむね順調に研究が進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
以上の通り、大きな問題は無く、順調に研究は進展しているので、これまでの研究の方向性を保ったまま、推進していく予定である。現在の最大の問題点は、最近の市販ハムスターの繁殖に関わる性質が変化（劣化）しており、過排卵処理後の性周期のずれと交配成功（in vivo 受精）の率の低下が著しいという点がある。この問題点は、同様のハムスターを用いている他施設でも生じており、大きな研究の障害になっている。今年度、抗インヒビン血清とeCG の混合液で性周期をずらさずに過排卵と妊娠が可能になることがわかった。また、新規の KO としては、受精関連因子のKOハムスターを開発し、受精における精子－卵子膜融合のメカニズム解明の一助としたい。新型コロナウイルスの新薬開発などに用いる糖尿病が発症すると期待されるノックハムスターが生まれているので、その表現型解析を急ぐが、良い抗体が無いために、western blot ができないのが問題である。RT-PCR を工夫するなどで、データを蓄積して行きたい。
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