2020 Fiscal Year Annual Research Report
核内微小環境の形成を介した転写動態制御の統合的解明
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19H03154
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
深谷 雄志 東京大学, 定量生命科学研究所, 講師 (00786163)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 転写バースト / エンハンサー / ライブイメージング / ショウジョウバエ初期胚 / 転写因子 / 天然変性領域 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
MS2レポーター遺伝子のプロモーター領域近傍にUAS配列を配置したDNAを持つショウジョウバエ系統を作製した。さらに、GAL4-VP16を初期胚で発現する系統を新たに作出し、それらを掛け合わせることでMS2レポーターの転写を人為制御可能なテザリングシステムの構築に成功した。ライブイメージング解析を行った結果、GAL4-VP16を介して非常に強い転写バーストが連続的に生み出される様子が観察された。次にUAS配列をプロモーター領域から6.5kb離れた場所に配置し、同様の実験を行った。その結果、GAL4-VP16単独をテザリングするだけで、遠位から標的遺伝子の転写バーストを生み出せることが明らかとなった。次にこの過程における天然変性領域の機能を調べるため、人為的にGAL4-VP16にポリグルタミン配列を付与した融合タンパク質を発現するショウジョウバエ系統を複数作出し、同様の解析をおこなった。その結果、天然変性領域の伸長が標的遺伝子からの転写バーストの誘導に対して促進的に作用することを新たに見出した。さらに転写因子そのものの局在変化を可視化するため、蛍光タンパク質を融合したGAL4-VP16を発現するショウジョウバエ系統を作製した。得られた初期胚を超解像顕微鏡によって解析したところ、転写バーストの誘導と同時にエンハンサー領域への局所的なGAL4-VP16の濃縮が起こっているという予備的なデータを得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
詳細な条件検討の結果、GAL4/UASシステムとMS2/MCPシステムを組み合わせた新たな実験系の構築に世界に先駆けて成功した。これまで、遠位エンハンサーによる転写活性化はDNAルーピングなどゲノムの構造変化を伴うものと信じされてきたが、本研究によりGAL4-VP16単独のテザリングのみで転写バーストを離れた位置から誘導できることを明らかにすることができた。これは、エンハンサー・プロモーター相互作用の分子メカニズムを理解する上で重要な知見であると言える。さらにこの過程における天然変性領域の機能についてデータを得るなど、順調な進展が見られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Airyscanシステムを用いた超解像イメージング解析の最適化と、超解像データの画像解析技術の開発を行うことで、転写活性化と局所的な転写因子の濃縮という２つの現象の間に存在する機能的な関連性を明らかにする。また転写活性化における天然変性領域の役割について、超解像ライブイメージングによる可視化解析についても並行して進める。加えて、以前我々が見出した単一エンハンサーによる複数遺伝子の同時活性化について（Fukaya et al., Cell 2016）、テザリングシステムを用いた再構築系の開発を進める。具体的にはConvergentに転写されるMS2レポーターとPP7レポーターの間にUAS配列を配置し、GAL4融合タンパク質のテザリングによって同調的な転写バーストが見られるか検証する。局所的な転写因子の濃縮による転写活性化の“ハブ”の形成が、本過程において重要な役割を果たすのであれば、天然変性領域の伸長は同調的な転写バーストの誘導効率を顕著に上昇させるものと考えられる。この可能性について、独自のMS2/PP7多色ライブイメージングとテザリングシステムを組み合わせることで、実験的な検証を進める。最終的には、明らかとなった作用機序に基づいてゲノム編集による内在転写因子の機能改変を行い、標的遺伝子の発現パターンや発生プロセスにおよぼす影響について評価を行うことを計画する。
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Research Products
(6 results)
