新規時間分解計測手法を用いた呼吸系エネルギー変換機構の解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03171
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 久保 稔 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (90392878)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: チトクロム酸化酵素 / 時間分解X線結晶構造解析 / 時間分解振動分光 / 動的構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

呼吸と生体エネルギー発生の機構は古くから人々の興味を惹きつけてきた生命科学の中心課題の一つであるが、その本質はミトコンドリアで行われているプロトンポンプにある。これを担っている巨大膜タンパク質がチトクロム酸化酵素であり、我々が呼吸で取り入れた酸素分子（O2）を利用して、プロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へポンプしている。本研究の目的は、時間分解X線結晶構造解析と時間分解分光解析を組み合わせた先端計測により、チトクロム酸化酵素のプロトンポンプ機構を原子レベルで明らかにすることである。反応の追跡には、紫外光照射によってO2を放出するケージドO2を用いる。
これまでにケージドO2の取り扱い方法を確立し、時間分解紫外可視吸収分光法を用いて、A中間体（活性中心にO2が結合した第一中間体）とF中間体（O2のO=O結合が開裂した後の第三中間体）の結晶中での捕捉に成功した。本年度は、反応の鍵となるP中間体（O2のO=O結合が開裂した直後の第二中間体）を捕捉できる反応条件を探索したが、期間内ではその確立に至らなかった。しかし共同研究者の研究により微結晶の分解能も向上している。本基盤研究の成果を土台に、A中間体とF中間体の時間分解X線結晶構造解析を進める見通しが立った状況である。時間分解赤外分光においては、多数の微小ウェルを集積した赤外セルを赤外顕微鏡に導入し、さらにケージドO2を励起するレーザー光を導入して、結晶試料の時間分解測定環境を整備した。チトクロム酸化酵素微結晶の測定には、試料部における嫌気条件の確立を残すのみである。
なお、本基盤研究で創出した技術は、他の呼吸酵素群の研究にも適用できる。中でもNO還元酵素に適用し、ケージドNOを用いることで反応中間体の結晶構造解析及び赤外分光解析に成功した。またケージドO2の酸素添加酵素研究への活用も進めており、多様な発展研究を図っている。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A synthetic model for the possible FeIV2(μ-O)2 core of methane monooxygenase intermediate Q derived from a structurally characterized FeIIIFeIV(μ-O)2 complex. (2022)
  • Author(s): Mikata, Y., Aono, Y., Yamamoto, C., Nakayama, H., Matsumoto, A., Kotegawa, F., Harada, M., Katano, H., Kobayashi, Y., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kajiwara, A., Kodera, M.
  • Journal Title: Inorg. Chem. Volume: 61 Pages: 786-790
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.1c02699
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography. (2021)
  • Author(s): Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 118 Pages: e2101481118
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Revisiting alkane hydroxylation with m-CPBA (m-chloroperbenzoic acid) catalyzed by nickel(II) complexes. (2021)
  • Author(s): Shinke, T., Itoh, M., Wada, T., Morimoto, Y., Yanagisawa, S., Sugimoto, H., Kubo, M., Itoh S.
  • Journal Title: Chem. Eur. J. Volume: 27 Pages: 14730-14737
  • DOI: 10.1002/chem.202102532
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Time-resolved infrared and XFEL analyses of P450nor reaction intermediates using caged-substrate. (2021)
  • Author(s): Kubo, M.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Combining time-resolved XFEL crystallography with IR spectroscopy for capturing P450nor reaction intermediates. (2021)
  • Author(s): Kubo, M.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Spectroscopic study on the action mechanism of Higd1a for activating cytochrome c oxidase (2021)
  • Author(s): 松村和香, 柳澤幸子, 西田優也, 長尾壮将, 新谷泰範, 久保稔
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Investigation of reaction intermediates of indoleamine 2,3-dioxygenase by using a stopped-flow Raman/absorption spectrometer (2021)
  • Author(s): 河村 味奈, 名定加峰, 柳澤 幸子, 久保 稔
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Structure of a heme-oxy intermediate of cytochrome P450BM3 catalyzing a non-natural substrate (2021)
  • Author(s): 桑野わ子, 長尾聡, 當舎武彦, Joshua Kyle Stanfield, 笠井千枝, 有安真也, 荘司長三, 杉本宏, 久保稔
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会（学生発表賞）