2019 Fiscal Year Annual Research Report
O-グルコース糖鎖修飾による筋衛星細胞におけるNotchシグナルの制御機構の解明
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19H03176
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
竹内 英之 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80361608)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡島 徹也 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (20420383)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | O-グルコース糖鎖 / 筋衛星細胞 / Notchシグナル / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは、次に示すような背景に基づいて本研究プロジェクトを開始した。ヒトの筋肉の再生と恒常性維持の分子機構は未だに理解されていない。遺伝性筋疾患である筋ジストロフィーの有病率は、人口10万人あたり20人程度と推定され、有効な治療法は存在しない。研究代表者は、Notch受容体のO-グルコース糖鎖修飾の異常により、筋肉の幹細胞である衛星細胞の数の減少と衛星細胞におけるNotchシグナルの低下が起こり、このことが、成人後に発症する肢帯型筋ジストロフィーの原因となることを見出した [Cell 2008, EMBO Mol Med 2016]。衛星細胞におけるNotchシグナルのO-グルコース糖鎖修飾による調節機構を明らかにすることが本研究の目的である。細胞生物学的手法により、O-グルコース糖鎖のNotch受容体選択性を調べる。遺伝学的手法を駆使した、世界初の糖鎖レポーターマウスを作製し、質量分析計を用いてNotch受容体上の糖鎖修飾の全貌を明らかにする。
本年度は、細胞生物学的手法により、ヒト培養細胞株における Notch 受容体の細胞内挙動に対する O-グルコース糖鎖変容の影響を観察した。また、Notch 受容体の細胞外部位に起こる糖鎖修飾を、質量分析計を用いた分子量の精密な分析により明らかにした。以上の実験データを論文としてまとめ投稿した。Notch 受容体機能の糖鎖修飾による制御機構に関する原著論文3 報、並びに、総説 2 報の発表に貢献した。
研究代表者は、研究成果について、アメリカ糖鎖生物学会においてポスター発表、第 92 回日本生化学会大会において招待口頭発表、日本筋学会第 5 回学術集会において招待口頭発表、第 7 回若手による骨格筋細胞研究会において招待口頭発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題1: NOTCH2およびNOTCH3の細胞外ドメインに O-グルコース糖鎖修飾が起こるか、そして、O-グルコース糖鎖修飾がNOTCH2およびNOTCH3 の活性化に必要であるか。研究代表者竹内が担当。HEK293T細胞にマウスNOTCH2の細胞外ドメインを発現させ、Ni-NTAアガロースカラムにより精製し、プロテアーゼにより消化後、Fusion LC-MS/MS (Thermo Fisher) にて解析した。NOTCH2 の細胞外部位に 36 個存在する上皮増殖因子様 (EGF) ドメインのうち、O-グルコース糖鎖付加のコンセンサス配列を有するEGF ドメインは、17 個存在する。17 箇所すべての O-グルコース糖鎖の種類とその割合を決定した。
課題 2: NOTCH1のEGF10に見出された新奇O-結合型糖鎖の性状解析とその生合成を担う糖転移酵素の同定。研究代表者竹内が担当。糖鎖構造解析は研究協力者の青木がジョージア大学で遂行。NOTCH1 EGF10 の O-グルコース修飾部位であるセリン378をアラニンに置換した。その結果、新奇糖鎖と従来型糖鎖の両方が消失することが確認された。リンケージ特異的なグリコシダーゼを用いた解析により、グルコースには beta1-4 結合でガラクトースが結合していることが示唆された。
課題3: Notch1糖鎖レポーターマウスを作製し、衛星細胞に発現したNotch1上のin vivo における糖鎖修飾を明らかにすること。研究代表者竹内と研究分担者岡島が担当。Bip分泌シグナル配列の直後にFLAGタグを挿入したNotch1 (FLAG-Notch1) が、テトラサイクリン応答因子 (TRE) の作用によって発現誘導されるベクターを作製し、マウス受精卵へのマイクロインジェクションと、偽妊娠させたマウスの卵管内への移植を終えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1: NOTCH2およびNOTCH3の細胞外ドメインに O-グルコース糖鎖修飾が起こるか、そして、O-グルコース糖鎖修飾がNOTCH2およびNOTCH3 の活性化に必要であるか。研究代表者竹内が担当。NOTCH3のO-グルコース糖鎖修飾を上と同様に解析する。HEK293T細胞にて、POGLUT1、GXYLT1、GXYLT2、XXYLT1を個々にノックアウトした細胞、およびGXYLT1とGXYLT2の両者をノックアウトした細胞を用いて、DLL1リガンド依存的なNOTCH2およびNOTCH3シグナルレポーターアッセイと、HEK293T細胞でNotchシグナル活性化の指標となる下流の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う。
課題 2: NOTCH1のEGF10に見出された新奇O-結合型糖鎖の性状解析とその生合成を担う糖転移酵素の同定。 研究代表者竹内が担当。糖鎖構造解析は研究協力者の青木がジョージア大学で遂行。化学的手法を用いて、新奇糖鎖構造の完全解明を試みる。新奇糖鎖修飾を担う糖転移酵素を同定するために、上で決定した糖鎖構造に基づいて、基質特異性から生合成を担う糖転移酵素遺伝子は、B4GALT 群に属することが推定された。そこで、コペンハーゲン大学Clausen博士らの作製した糖転移酵素遺伝子欠損HEK293 細胞株を入手し、NOTCH1を発現させ、質量分析により新奇糖鎖修飾が消失するか調べる。
課題3: Notch1糖鎖レポーターマウスを作製し、衛星細胞に発現したNotch1上のin vivo における糖鎖修飾を明らかにすること。研究代表者竹内と研究分担者岡島が担当。マイクインジェクションにより得られた子マウスの離乳後、尻尾より DNA を抽出し、PCR 法により導入遺伝子の検定を行う。胎児由来線維芽細胞を用いて、Notch1 タンパク質の発現誘導実験を行う。
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