2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of Molecular Mechanisms of Protein Translocation across the Chloroplast Envelope
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19H03183
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中井 正人 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (90222158)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / タンパク質膜透過 / タンパク質輸送 / オルガネラ / 生合成 / 超分子複合体 / 膜タンパク質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画の目的は、植物を支える葉緑体の形成の根幹メカニズムの全容を解明する点にある。葉緑体が有する光合成システムは、数千の葉緑体蛋白質が正しく葉緑体内へ運ばれアセンブリーすることにより維持されている。この輸送はATPの加水分解エネルギーを必要とし、外包膜と内包膜の蛋白質膜透過装置、TOCおよびTICトランスロコンと、Ycf2輸送モーターによって行われている。われわれはこれまでの研究によりTICとYcf2輸送モーターがそれぞれ１メガダルトン、２メガダルトンという巨大膜蛋白質複合体であることを明らかにし、それぞれすべての構成因子を決定することに成功している。また、これらメガコンプレックスが外包膜と内包膜の２つの膜を介して接触した超複合体を形成していることが分かった。これらメガコンプレックスがどのように連動して葉緑体蛋白質をサイトゾル側からストロマ側まで輸送しているのか作動原理については、各複合体や超複合体の３次元立体構造情報が必要であるが、葉緑体のこれら複合体の存在量が多くなく、また精製方法に問題点もあり、まだ成功していない。そこで本研究では、精製に適した出発材料から見直し、TOC-TIC-Ycf2モーターが３者複合体として安定に単離できるような精製方法の確立を目指す。
現在までに確立されたTICとYcf２輸送モーターの中核因子に精製用のアフィニティタグが付加された形質転換ラインについて、最適な栽培条件の検討と、多量の葉緑体精製条件の検討を進めた。新奇に開発されたデタージェントも数種類試しており、データを解析中である。また、精製の際、市販のアフィニティ樹脂では、効率が悪く、また、樹脂量当たりの単価が非常に高く、多量の生成条件の検討には適さない。最近、このアフィニティ樹脂そのものを自前で調製することにも成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究がターゲットする膜蛋白質複合体は、存在量が少なく、また、サイズが大きく、２枚の膜をまたいで存在しているため、精製は非常に難しい。高度な精製には、複合体の因子に、精製に効果的なアフィニティタグを付加すること、その形質転換体からの多量の試料調製法の確立、ならびに、最終標品への高度精製方法の確立、の３ステップの改良が必須である。
これまでの研究により、確立されたTICとYcf２輸送モーターの中核因子に精製用のアフィニティタグが付加された形質転換ラインについて、最適な栽培条件の検討と、多量の葉緑体精製条件の検討を進めた。新奇に開発されたデタージェントも数種類試しており、データを解析中である。また、精製の際、市販のアフィニティ樹脂では、効率が悪く、また、樹脂量当たりの単価が非常に高く、多量の生成条件の検討には適さない。最近、このアフィニティ樹脂そのものを自前で調製することにも成功しており、各ステップに予想通りの進展が見られる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度においては、これまでの解析をさらに進め、精製条件の最適化を進めていく。すなわち、形質転換体を通常の光条件で3~4週間育て葉緑体を単離する。これをマイルドなデタージ ェントにより可溶化を行う。この際、TOC-TIC-Ycf2複合体の3者複合体は低塩濃度にて、TOC、TICおよびYcf2複合体を個別に 精製する場合には、高塩濃度にて行う。この可溶化物を自前で作成したアフィニティ樹脂ビーズを用い効果的な精製条件の検討を行 う。また、適宜、電顕観察に推奨されるデタージェントへの置き換えを行う。具体的には、上記ビーズからの溶出の直前に段階的にデタージェントを置き換える方法、さらに、超遠心で複合体を沈降させる時に連続的にデタージェ ントを置き換えるGraDeR法を試し、クライオによる構造決定のための試料調製方法を確立させる。
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