Elucidation of Molecular Mechanisms of Protein Translocation across the Chloroplast Envelope

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03183
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 中井 正人 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (90222158)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細胞内蛋白質輸送 / 蛋白質膜透過 / オルガネラ / 葉緑体 / 生合成 / 超分子複合体 / 超分子複合体 / 植物

Outline of Annual Research Achievements

本研究計画の目的は、植物を支える葉緑体の形成の根幹メカニズムである蛋白質輸送機構の全容を解明する点にある。葉緑体が有する光合成システムは、数千の葉緑体蛋白質が正しく葉緑体内へ運ばれアセンブリーすることにより維持されている。この輸送はATPの加水分解エネルギーを必要とし、外包膜と内包膜の蛋白質膜透過装置、TOCおよびTICトランスロコンと、Ycf2輸送モーターによって行われている。われわれはこれまでの研究によりTICとYcf2輸送モーターがそれぞれ１メガダルトン、２メガダルトンという巨大膜蛋白質複合体であることを明らかにし、それぞれすべての構成因子を決定することに成功している。また、これらメガコンプレックスが外包膜と内包膜の２つの膜を介して接触した超複合体を形成していることが分かった。これらメガコンプレックスがどのように連動して葉緑体蛋白質をサイトゾル側からストロマ側まで輸送しているのか作動原理については、各複合体や超複合体の３次元立体構造情報が必要であるが、まだ構造解析に適した複合体精製には、世界のどの研究室においても成功していない。本研究では、精製に適した出発材料から見直し、精製用のタグを付加した形質転換体数種類のスクリーニングや、デタージェントの種類や塩濃度などの可溶化条件、タグ精製用の樹脂の検討、アフィニティ精製前の前処理ステップの効果、最終濃縮方法、などについて、検討を進めている。本年度は、前処理ステップとして、イオン交換カラムによる精製を、また、最終濃縮ステップでは、超遠心法と限外濾過法等を試した。包膜のタンパク質輸送装置は、その含有量が少なく、ステップを増やせば精製度は上がるが収量が下がり、構造解析に十分な精製量を確保することが困難になる。よりシンプルで収量も良く精製度も高い精製条件を最終的に詰める段階にきている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

作成してきたタグ付加型の植物形質転換体は概ね出揃い、それを用いた詳細な精製方法の比較を進めることができた。それぞれのタグに応じた精製方法を検討する一方で、タグ付加が複合体の発現量や安定性に与える影響も昨年度に引き続き検討した。また、複数のデタージェントの使用濃度やその組み合わせも、可溶化実験において試すことができ、それぞれの最終精製物の収量や純度に与える効果についても比較できている。また、精製に用いるアフィに二ティー樹脂については、昨年度までは、リガンドとタグの相性に重点を置いて検討してきたが、本年度は、樹脂を形成する担体の形状や性質にも着目した。本研究がターゲットとする蛋白質の輸送装置は１メガダルトン、２メガダルトンと、非常に巨大である。したがって、樹脂担体の排除限界やリガンドとの立体障害がそのアフィニティ結合容量に大きく影響することが予想される。実際、同じリガンドを持つアフィニティ樹脂でも、排除限界の小さい担体では、複合体精製量が著しく低かった。またリガンド自身も、より分子サイズの小さいものに変更した方が、精製量が増加した。以上の結果をふまえ、市販のものにアフィニティ樹脂に頼るだけではなく、自前でより効果的なアフィニティ樹脂の調製にも精製している。さらに、アフィニティ精製と組み合わせるサンプルの前処理や、最終標品の濃縮方法においても、条件を詰めることができている。

Strategy for Future Research Activity

これまで検討してきた、タグ付加型植物の絞り込み、可溶化条件の絞り込み、精製前処理の絞り込み、アフィニティ樹脂の改良、濃縮方法の改良、等の条件設定を完了させた上で、最終精製条件の確立を進めていく。確立できれば、精製標品を用いた、ネガティブ染色による電顕像、およびクライオ電験による電顕像の取得へと進む。いずれの場合も、バッファー組成やデタージェント組成が画像解像度に影響を与える事が知られている。そのため、必要であれば、精製途中、あるいは最終標品調製時におけるバッファー組成、デタージェント組成の最適化、あるいは置換を検討し、より構造解析、３D構築に良好な精製標品の調製を目指す。そのような条件が確立できれば、構造解析を推進すると同時に、次の目標となる、蛋白質輸送装置の作動時の構造解析を目指した精製標品の調製にも挑戦する事が可能となる。具体的には、精製前に、無傷葉緑体を用いたin vitro輸送実験を行い、輸送中間体を蓄積させる。そのような葉緑体から複合体を精製し、構造解析する事ができれば、蛋白質を輸送途上の複合体の構造情報が得られ、複合体のどの部位を通って蛋白質が運ばれて行くのか、どのような複合体の構造変化が蛋白質輸送を引き起こしているのか、運ばれる蛋白質はどのような状態で運ばれているのか、等、葉緑体の形成の根幹メカニズムである蛋白質輸送機構の全容解明に近く事ができると期待している。