2020 Fiscal Year Annual Research Report
PMQCにおけるユビキチン化制御分子の機能解明と治療的応用
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19H03185
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
沖米田 司 関西学院大学, 理工学部, 教授 (90398248)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 照也 熊本大学, 大学院先導機構, 准教授 (40433015)
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70432804)
石黒 洋 名古屋大学, 総合保健体育科学センター, 教授 (90303651)
福田 亮介 関西学院大学, 理工学部, 助教 (90825308)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ユビキチンリガーゼ / タンパク質品質管理 / CFTR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. QC 関連E3 リガーゼの X 線結晶構造解析：QC 関連 E3 リガーゼ RNF5 delta TM, RNF185 delta TM の結晶化を試みたが，現在の所，結晶化に成功していない．天然変性領域を欠失させた新しい RNF5, RNF185 発現コンストラクトを構築したため，再度，結晶化を試みる．
2. QC 関連DUBスクリーニング：AlphaScreen により，CFTR NBD1 に結合する DUB を見出した．これらの DUB と CFTR NBD1 の結合は構造依存的であった．培養細胞を用いた過剰発現実験において，CFTR 変異体の発現や細胞内安定性を制御するDUB を見出した．網羅的解析により，QC 関連 E3 リガーゼと結合し，その細胞内発現量を制御する DUB 分子を見出した．
3. QC 関連E3 リガーゼ KO 細胞における CFTR Ub コード解析：Ub ELISA 法により，各種 E3 KO 細胞での CFTR 変異体の K48-Ub, K63-Ub 化への影響評価を行なった結果，E3リガーゼによる CFTR Ub 化制御に Ub 鎖特異性は見られなかった．
4. CFマウスにおけるCFTR活性評価法の確立：CFマウス単離膵管において，CFTR 改善薬が fluid secretion を増加させた．従って，本手法でCFマウス単離膵管での CFTR 活性を評価可能であると考えられた．生マウスにおける鼻粘膜電位測定法 (NPD) による CFTR 活性評価法は確立できていない．
5. CF-HBE CFTR 活性に対する E3 KD の影響解析：CFTR 関連 E3 KD により，CF-HBE での delta F508 CFTR チャネル活性の改善が見られた．現在，CFTR 関連 E3 の KD 効率が低いため，今後，transfection 方法の改良を行う．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CFTR 変異体と QC 関連 DUB を用いた網羅的解析から，QC 関連 DUB 候補を同定することに成功した．また，一部の QC 関連 E3 の作用機序が明らかになりつつあり，今年度中に論文投稿の予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
1. QC 関連 DUB の作用機序解析を進める．同定した E3-DUB 複合体が生成する Ubコードを解析する．
2. RNF5, RNF185 について X 線結晶構造解析を進めるが，問題があれば NMR 解析も行う．
3. マウスにおける CFTR 評価法は，単離膵管モデルだけではなく，生マウスにおける鼻粘膜電位測定法確立も進める．
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Research Products
(6 results)
