2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19H03186
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| Research Institution | High Energy Accelerator Research Organization |
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Principal Investigator |
田辺 幹雄 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特任准教授 (00716871)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野村 紀通 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10314246)
樹下 成信 岡山大学, 自然生命科学研究支援センター, 助教 (60646917)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 多剤排出トランスポーター / 病原菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌が薬剤耐性を引き起こす原因の一つであるMajor facilitator superfamily(MFS)型の多剤排出(multidrug resisitance - MDRと略す)トランスポーターの薬剤認識とその輸送機構の解明を目指している。本課題は以下の２つの目標を掲げている。1)MFS型MDRトランスポーターのモデルタンパク質であるMdfAを使い生化学、構造解析、シミュレーションを用いて、薬剤分子の認識やその排出の輸送サイクルを明らかにする。2) 新規の病原菌由来の輸送体の構造解析を行い、薬剤輸送機構の解明を目指す。本年度は1)は我々が構造を決定した基質なしの外開き構造に加え、新たな構造を得ることを目標に、特定の構造を認識しうる抗体を得た。現在4つの抗体が得られ、順にどのような構造状態を認識しているかをクライオ電顕を用いて確認している最中である。2)新たにAcenetobacterとStreptcoccus由来２つのトランスポーターの発現と精製手法の確立した。現在結晶化を試みると同時に活性測定を開始する寸前まで精製度を高めることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２つの課題に関して、1)MdfAは特定の構造を認識する抗体を４種類用いて、輸送サイクルの新たな構造状態を同定するための実験を開始した。抗体はすでに調整済みで、クライオ電顕も利用しての観察も開始した。概ね進行は予定通りである。2) 新規の病原菌由来の輸送体の構造解析については、ある程度精製に見込みが立っていたトランスポーターに関しては、想像よりもアッセイ系に利用する再構成のために必要な精製タンパク質の安定性に乏しく、それが解決できるまでは暫く進行を見合わせているが、別に新たにクローニングを行ったAcenetobacterとStreptcoccus由来の２つの輸送体の発現と精製手法の確立することができた。こちらに関しては予定のトランスポーターについて全てを行うことはできなかったものの、異なる多剤耐性トランスポータに関して得られる知見は新たな事実も得られることを期待しており、医学的にも重要な感染症であることから、当初と同様の期待をしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究企画した当初の予定から大規模な変更はなく、引き続き、研究を遂行していく予定である。
1)現在用意ができている抗体とMdfAの複合体の構造解析をクライオ電顕単粒子解析を行なった。現在２次元分類を行っている初期段階であるが、抗体とMdfAの複合体の像の確認ができているため、引き続き新たな構造状態を得ることができるように観察条件を検討し解析を行っていく。
2)に関しては概ね順調であるが、当初計画していたトランスポーターstaphylococcus aureus由来のNorA, NorB, Streptcoccus pyrogenes由来のMefAが構造解析や、生化学アッセイに安定的に耐えられるだけの安定性がなかったため、細菌は異なるものの、似た性質を持つAcenetobacterとStreptcoccus由来のトランスポーター多剤耐性輸送体を生成し、目的を行うため精製を行っている。活性測定と抗体の作成の予定を立てたため、出来る限り予定に従い共同研究者とともに研究を進める予定である。
1)2)とも、現在はコロナ感染症の影響でクライオ電顕、放射光施設は、申請者が所属するKEKも含め施設が稼働が制限されており、進行に遅れが懸念される。これに関しては状況を見つつ対応していく他ないが、柔軟にできることから対応していく予定である。活性測定と抗体の作成の予定も共同研究者と共に予定を立てた。こちらもコロナ感染症の影響による施設のアクセス制限のため少しずれ込む可能性があるが、多少予定を押すことがあっても不可欠なステップであるため遂行予定している。
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