2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the regulatory mechanism of phase separation for transcliption by developing a correlative analysis method of nano-scale localization and dynamics
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19H03192
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
徳永 万喜洋 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (00192659)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 生物物理 / バイオイメージング / 細胞情報・動態 / 超解像顕微鏡 / 生体分子計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
超解像顕微鏡法と１分子イメージングの同時観察から得られる分子局在・分子動態・分子間相互作用の定量データ群を、統合的に関連付ける新しい方法として、“動態・局在ナノ相関解析法”を開拓し、遺伝子発現制御に適用し、新たな概念を創出することを目的として、次を行った。
１．高速超解像・１分子イメージング同時観察顕微鏡の構築。生細胞で４色までの多色に対応し、高精度の高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングとを同時に観察できる蛍光顕微鏡として、現有設備を基に従来開発技術を改良しつつ行った。２．蛍光標識分子の調製。超解像用にはphoto-activable/-switchable FP、１分子イメージング用にはGFPやSANP等の各種tag蛍光色素と、目的タンパク質遺伝子（RNAポリメラーゼII、種々のヒストンvariant等）との組合せ選定を行った。３．１分子イメージングによる動態解析。申請者らの開発した、分子動態を時間・空間の関数として定量計測する方法である移動部分軌跡解析法に関し、部分軌跡の平均二乗変位MSD(t)から定量情報を得る方法の改良を行った。４．超解像解析。局在化方式(PALM/STORM) 超解像のナノ局在解析に、通常のRipley's K-function法の他に種々解析法を導入・考案し、多様なデータに対応できる方法を検討した。５．領域マーカー対応。多色画像間の位置重ね合わせ精度の高精度化を行った。６．“動態・局在ナノ相関解析法”の開拓。分子局在・分子動態を相関解析する解析方法の検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超解像顕微鏡法と１分子イメージングの同時観察から得られる分子局在・分子動態・分子間相互作用の定量データ群を、統合的に関連付ける新しい方法として、“動態・局在ナノ相関解析法”を開拓し、遺伝子発現制御に適用し、新たな概念を創出する目的を達成すべく、本年度の研究計画６項目を推進した。「１．高速超解像・１分子イメージング同時観察顕微鏡の構築」においては、生細胞で４色までの多色対応蛍光顕微鏡として、現有設備を改良しつつ進展をみた。「２．蛍光標識分子の調製」においては、GFP等の蛍光タンパク質・各種tag蛍光色素と、目的タンパク質遺伝子（RNAポリメラーゼII、種々のヒストンvariant等）との組合せとして、超解像と１分子イメージングとを同時に行えるものを見い出した。「３．１分子イメージングによる動態解析」においては、申請者らの開発した、分子動態を時間・空間の関数として定量計測する方法である移動部分軌跡解析法に関し、部分軌跡の平均二乗変位MSD(t)から定量情報を得る方法として以前より精度の良い方法を見い出した。「４．超解像解析」においては、局在化方式(PALM/STORM) 超解像のナノ局在解析に、通常のRipley's K-function法の他に種々解析法を導入・考案することにより、多様なデータに対応できる方法の進展をみた。「５．領域マーカー対応」においては、多色画像間の位置重ね合わせ精度を高めることができた。「６．“動態・局在ナノ相関解析法”の開拓」においては、分子局在・分子動態を相関解析する解析方法として新しい方法を導入・考案した。いずれも、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．高速超解像・１分子イメージング同時観察顕微鏡の改良。生細胞で、高精度の高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングとを同時に観察できる４色までの多色対応蛍光顕微鏡を、昨年度構築したものに照明系・Autofocus系・結像系の高画質化を中心に改良を加える。このために、位相変調器と波面センサーを導入する。２．蛍光標識分子の調製。超解像用のphoto-activable/-switchable FP、１分子イメージング用のGFP/SNAP-tag蛍光色素等の、目的タンパク質遺伝子への導入に関し、昨年度成果に、ミュータントタンパク質、ヘテロクロマチン関連分子等を加え、蛍光標識との組合せの多種化を行う。３．１分子イメージングによる動態解析。昨年度に引き続き、移動部分軌跡解析法により分子動態を時間・空間の関数として定量計測する方法を、昨年度に引き続き改良を進め、拡散係数や運動の種類の定量情報をより正確に求め、各情報の時間・空間の関数としての定量値の精度を高める。４．超解像解析。局在化方式超解像のナノ局在解析のより高精度化と、解析方法の多様化を、昨年度に引き続き行う。５．領域マーカー対応。超解像、１分子軌跡、領域マーカーの多色画像を重ね合わせ、分子局在・分子動態・相互作用を、注目する領域と関連付けながら時間・空間の関数として定量する方法の開拓を推進する。６．“動態・局在ナノ相関解析法”の開拓。超解像顕微鏡法と１分子イメージングの同時観察から得られる、分子局在・分子動態・分子間相互作用の定量化した諸量を、相関解析し統合的に解析する方法の改良を進めることにより、 “動態・局在ナノ相関解析法”の開拓を推進する。
［研究協力者］東京工業大学・生命理工学院 伊藤由馬 クロマチン動態１分子超解像観察と解析、東北大学・大学院農学研究科 十川久美子 多色蛍光標識分子導入細胞群の構築
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