2020 Fiscal Year Annual Research Report
膜電位と張力が抗菌ペプチドや細胞透過ペプチドの機能に与える効果とメカニズムの解明
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19H03193
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
山崎 昌一 静岡大学, 電子工学研究所, 教授 (70200665)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡 俊彦 静岡大学, 電子工学研究所, 准教授 (60344389)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 単一巨大リポソーム法 / 抗菌ペプチド / 細胞透過ペプチド / 脂質膜中のポア形成 / ペプチドの膜透過 / 膜電位 / 生体膜のイメージング / 生体膜のダイナミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１，マガイニン２ (Mag) の巨大リポソーム(GUV) の膜中のポア形成に対する膜電位の効果を、最近我々の研究室で開発された方法を用いて研究した。ポア形成の速度定数kpは負の膜電位の増加とともに増加することを見出した。また、蛍光ラベルしたMag（CF-Mag）とGUVの相互作用を共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)により観測すると、GUVの外側の単分子膜の膜界面でのCF-Mag濃度(XOM)の時間変化を測定することが可能である。負の膜電位が増加するにつれて、XOMは増大した。さらにこの結果を理論的に解析し、合理的に説明することに成功した。この現象のメカニズムとして、負の膜電位の増大につれてXOMの増加が起こり、それが内側単分子膜の張力を増大させてポア形成の速度定数を増大させたと考えられる。
２，蛍光プローブによるラベルがペプチドと膜との相互作用やペプチドの細胞内で挙動に影響を与える場合がある。本研究では、蛍光プローブでラベルされていない細胞透過ペプチド(CPP)のGUVの内腔への侵入やそこでの濃度を検出する方法を初めて開発することに成功した。この方法では、高い濃度の蛍光プローブ・カルセインを含む100 nmの直径のリポソーム（LUV）を多く含むGUVを用いる。この状態は自己消光によりGUV内腔の蛍光強度は小さい。CPPがGUV内腔へ侵入して、LUVと相互作用してカルセインの漏れを誘起すると、自己消光が解消され蛍光強度が増大する。この方法を用いて、蛍光ラベルされていないCPPのトランスポータン10 (TP10)のGUV内腔への侵入をCLSMを用いた単一GUV法により研究した。その結果、TP10はGUVの膜にポア形成をせずに膜を透過してGUV内腔に侵入することを見出した。TP10の侵入の時間経過をモニターすることができた。また、その侵入速度はペプチド濃度ともに増加した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
抗菌ペプチドによる脂質膜中のポア形成に対する膜電位の効果、生理的イオン濃度下での浸透圧によるGUVの膜にかかる張力の定量的評価、蛍光プローブなどでラベルされていない細胞透過ペプチド のGUV内腔への侵入の検出方法の開発などに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）抗菌ペプチドのポア形成に対する膜張力の効果。我々は最近、生理的イオン強度下で浸透圧により発生するGUV膜の張力を定量的に求めることに成功している。この結果に基づいて浸透圧によりGUV膜に張力を与えることによって、マガイニン２やその他の抗菌ペプチドのポア形成がどのように変化するかを単一GUV法により定量的に研究する。特にポア形成の速度定数や蛍光プローブの膜透過速度定数の浸透圧依存性を定量的に求める。さらに、それらの結果を理論的に解析する。また、マガイニン2と細菌やそのスフェロプラストの相互作用に対する浸透圧の効果を研究し、生きた細胞の細胞膜中での抗菌ペプチドのポア形成に対する膜張力の効果を解明する。
（２）抗菌ペプチドPGLaの膜透過とポア形成の研究。PGLaの脂質膜中のポア形成や膜透過を単一GUV法により研究して、その素過程やメカニズムを研究する。特に蛍光プローブでラベルされていないPGLaを用いてこれらの実験を行い、蛍光ラベルされたPGLaの結果と比較考察する。さらに、PGLaの膜透過やポア形成に対する膜張力や膜電位の効果を研究する。
（３）細胞透過ペプチドの膜透過に対する膜電位の効果。トランスポータン10 (TP10)やラクトフェリシンBのフラグメントであるLfcinB (4-9)の細菌やスフェロプラストの細胞膜での膜透過に対する膜電位の効果を研究し、GUVでの膜透過に対する膜電位の効果と比較考察する。膜電位の効果のメカニズムを解明するために、膜電位のよる膜物性の変化をGUVを用いて研究し、その結果を理論的に解明する。
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