2019 Fiscal Year Annual Research Report
逆転写酵素による鋳型非依存的な塩基付与の法則の理解と完全長cDNA合成の精緻化
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19H03214
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
笹川 洋平 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (10404344)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ターミナルトランスフェラーゼ / 完全長cDNA / ポリAタギング / cDNA変換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ターミナルトランスフェラーゼ依存的なアダプター付与によるcDNA変換効率を抜本的に改善し、超微量RNAからの全長cDNA分子の配列取得を目指す。超微量RNAから全長cDNA分子の配列を取得するには、①逆転写酵素により、RNAの3’末端から5’末端まで完全長cDNAを合成し、②完全長cDNAを増幅可能な形に変換（cDNA変換と呼ぶ）。その後、③DNA polymeraseなどで増幅し、長鎖DNAシーケンサーで配列を取得する必要がある。RNA分子の検出感度には②が、RNA配列の全長配列検出には、①③が重要である。最終的には、これら全ての因子を組み合せないと目的を達成することが出来ないが、②の効率が低いことが、最も大きな技術的な障壁となっている。以上３項目に分けて、今年度の実績を以下記載する。
①まず市販の逆転写酵素を全てリストアップし、4種類を調達した。3’から5’へのcDNA合成の効率を計測する評価系を構築ならびにデータ解析方法を検討した。②では、cDNA変換の効率を計測するために、人工的なRNAを合成し、定量PCRならびにsequencerで定量可能な評価系を立ち上げた。cDNA変換には、2種類の方法（poly-A tagging法とTemplate switching法）があるが、どちらも緩衝液よって、大きな影響を受けることが分かり、最適な条件をみつけるスクリーニングが有効だと考えられた。それに必要なセットアップを行った。特に多種類の反応液の調整が重要であるため、複数ロボットの特性調査を行った。またデータ解析は、1細胞RNA-seqの解析パイプラインを転用できた。③では、長鎖DNAシーケンサー(Nanopore)での検出を試みて、シーケンスデータを取得したが、塩基配列の正確性が足りない事がわかったので、別シーケンサーを検討する必要があることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
完全長cDNA配列取得のためのcDNA変換には、2種類の方法（poly-A tagging法とTemplate switching法）がある。両方のcDNA変換効率をqPCRで計測できる評価系を立ち上げた。また同評価系で用意したRNAから、シーケンスライブラリをハイスループットに用意し、数千条件同時に読み取ることが可能で、効率を上昇させる因子のスクリーニングを可能にする目処がたち、計画通り進んだ。
また計画遂行中、他グループから本テーマに関連する論文が報告された。template switchingでは、逆転写酵素による鋳型非依存的な塩基付与と、アダプターオリゴ相補鎖合成が、協調もしくは競合的に起きて、アダプターが付与される作用機序であることが示唆された(doi: 10.1074/jbc.RA119.010676) 。同論文はtemplate switchingの高効率化しにくい特性を示していた。報告者は、poly-A taggingを使用したQuartz-Seq2 (https://doi.org/10.1038/s41587-020-0469-4)と、Template switchingで最も性能が高いSmart-seq3 (https://doi.org/10.1038/s41587-020-0497-0)
を、本年度再解析した。同一解析条件で比較した結果、ヒトB細胞で、Quartz-Seq2がSmart-Seq3の2倍の検出遺伝子を捉え、poly-A taggingの優位性が強く示唆された。これら知見を、本研究計画に反映させ、一部計画を修正ならびにスクリーニング計画の一部を前倒しし、影響を与える因子のスクリーニングについての予備実験を行うことができた。これら全般を加味して、おおむね想定の範囲内の進捗だと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究により、cDNA変換効率の改善のkeyの一つが、緩衝液や低分子化合物であることが示唆されている一方、どの成分やその組み合わせが重要であるか不明でスクリーニングなどによる探索が必要である。そのためにはスクリーニング対象の緩衝液の種類に関する探索空間の把握が極めて重要であることが考えられた。
2020年度は、まずスクリーニング対象となる緩衝液の種類や成分、またその組み合わせパターンを網羅的にサーベイして、探索空間を把握する。次に、実際に個々の組成を調達し、自在に混合させ、多種多様な緩衝液を自由に作製できるようにする。具体的には、自動分注ロボットにcherry-picking programを導入して、実験計画法に基づく任意の組み合わせで調液するなどを検討する。緩衝液のライブラリができたら、実際に反応させてみて、cDNA変換効率を計測し、最適値を探す。最近Wulfら(Wulf et al. 2019, JBC)の論文で報告されている計測系の導入の検討もあわせて行う。
長鎖cDNAをシーケンスするには、逆転写反応で長いcDNAを合成できることと、シーケンスするために必要なDNA量を稼ぐためのPCR増幅反応が必要である。昨年度に引き続き、長鎖cDNA調整において、最適な逆転写酵素、PCR酵素の組み合わせを、RNAシーケンス法を活用して決定する。また長鎖DNAシーケンサーでの解析手法も検討する。市販されている逆転写酵素の殆どはは、Moloney Murine Virus 由来であり、選択肢が少ない。市販されていない逆転写酵素については、タンパク質合成し、評価系に加えることも検討する。
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