2020 Fiscal Year Annual Research Report
Studies of the cell autonomy and tissue dependency of clock-gene functions in plants
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19H03245
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小山 時隆 京都大学, 理学研究科, 准教授 (30324396)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 概日時計 / 植物 / 細胞 / 遺伝子機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、植物において概日発振の基本単位となる細胞の視点から、植物の概日時計システムの理解を目指すものである。特に、細胞レベルの概日リズムの挙動を直接観測することで、細胞レベルでの遺伝子機能や組織／器官レベルでの細胞時計間の同期状態などを統合的に把握する計画となっている。前年度に確立したシロイヌナズナでのCRISPR/cas9系と概日発光レポーターの共導入による単一細胞時計遺伝子機能解析法を用いて、20余りの概日時計関連遺伝子の一細胞レベルの遺伝子破壊がその細胞の概日リズムに与える影響評価を進めた。この系においては、概日発振の転写・翻訳フィードバックループに直接的に関与する時計因子の破壊で細胞概日リズムへの影響が見られることが分かりつつある。また、これまでは細胞時計の挙動をしめす典型的な時計遺伝子プロモーターとしてCCA1:LUCを用いてきたが、新たな概日発光レポーターCaMV35S:LUC（あるいはPtRLUC）が細胞時計の挙動と非連結的な挙動を示すことを２つの発光波長の異なるルシフェラーゼを利用した単一細胞２波長発光測定系を用いて示した。この発光レポーターは発光している細胞周辺の概日リズムの挙動を示している可能性があり、このレポーターを用いることで、単一細胞の遺伝子破壊が組織レベルの概日リズムに与える影響も評価できる可能性を示した。これら質的に異なるレポーターへの様々なエフェクターの効果を比較することで、本研究課題達成が促進されると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究2年目となる2020年度は、CRISPR/cas9系による時計遺伝子破壊コンストラクトの作製およびその影響評価を進めることができた。さらに、一部の時計遺伝子については過剰発現の影響評価を細胞レベルで進めた。これらの解析のなかでは、細胞／実験間での測定結果のバラツキが問題となっているが、バラツキを含めた形の解析データ評価法を確立しつつある。また、単離細胞の単一細胞レベルの概日リズム解析も進んでおり、葉と根の細胞の概日リズム特性の違いを明らにした。プロトプラストは遺伝子導入等が可能であり、これらを実験対象とすることで、器官／組織特異的な時計遺伝子機能へのアプローチが容易になる。また、細胞時計の挙動とは異なる特性をもつ概日リズムを生じる発光レポーターを見つけたことで、細胞レベルの時計遺伝子機能の分類の新たな軸をつくることができた。単一細胞レベルの解析に注力した一方で、変異体ベースの実験は一部の解析にとどまった。上記のように本研究課題の重要な部分については、大きな進展が見られたため、本研究は概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は、作製したエフェクターコンストラクトの効果を複数の軸（同期状態、レポーターの種類、組織、測定時環境条件の違い等）で確かめ、細胞時計に対する遺伝子機能を分類する。また、一過的発現系による（単一細胞）発光レポーター解析に加えて、発光レポーター遺伝子をもつ形質転換体をベースにした単一細胞発光レポーター測定系の開発を行う。この系を用いることで、時計遺伝子の発現量にあたえるエフェクターの効果などを、高い定量性／均質性で解析できると期待される。これまで開発した実験系と合わせて、細胞レベルから植物個体レベルへと繋ぐ概日時計システムの仕組みについて解析する。これらの成果をもとに、時計遺伝子機能について既知の研究成果との整合性を検討し、概日時計システムの新たな展望像を描く。
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