2019 Fiscal Year Annual Research Report
Chemical biology study on auxin inactivation pathway
| Project/Area Number |
19H03253
|
|---|
| Research Institution | Okayama University of Science |
|---|
Principal Investigator |
林 謙一郎 岡山理科大学, 理学部, 教授 (30289136)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笠原 博幸 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00342767)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 植物ホルモン / オーキシン / ケミカルバイオロジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
植物ホルモンの細胞、組織・器官での濃度制御は、ホルモンの生合成のみならず、その代謝不活性化によって精緻に制御を受けており、そのホルモン濃度の調節は植物の分化・成長においてきわめて重要である。オーキシンであるindole 3-acetic acid (IAA)のホルモン活性も、生合成、極性輸送、シグナル伝達系および不活性化により、協調して精緻に調節される。これまでIAAは、酸化経路（DAO経路）とアミノ酸複合体化経路（GH3経路）の2つの独立した経路で不活性化を受けると提唱されてきた。GH3酵素が触媒するIAAのアミノ酸複合体化と、DAO酵素が触媒するIAAの酸化経路について、ケミカルバイオロジーの手法により酵素反応学的性質や生理学的意義を解明し、オーキシンホメオスタシスの分子基盤を形成するオーキシンの代謝不活性化経路の全貌解明を目的として、研究に着手した。本研究課題の初年度に、アミノ酸複合体化経路の主酵素であるGH3-1からGH3-17の8種のGH3酵素と酸化経路（DAO経路）を担うとされているDAO1、DAO2の2種の酵素の過剰発現体や欠失変異体、多重変異株の作成を行った。また、GH3酵素により不活性化されたIAA－アミノ酸複合体を加水分解して再活性化するILR1・ILL酵素の挿入変異体を同定し、その多重変異株を作成した。さらに、IAAからの代謝物フローを解析するために、想定されるIAA代謝物の安定同位体標識体の合成を行った。これら変異体の表現型の解析と、GH3阻害剤に対する感受性を検討した結果、IAAの代謝経路では、GH経路が主経路として存在すると推定された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までの研究進捗状況は、研究目的であるオーキシンホメオスタシスの分子基盤を解明するため、研究計画に沿って次の3項目の研究を推進した。（１）「GH3酵素阻害剤・IAA-アミノ酸誘導体の評価」（２）「不活性化酵素の欠失変異株・過剰発現体の作成と代謝中間体の精密定量」（３）「不活性化酵素の機能解析」の三つの課題に分けて研究を進めた。（１）オーキシン不活性化経路の特異的な阻害剤であるGH3酵素阻害剤を用いた植物の表現型解析については、論文既報のdao1-1変異体、gh3 6重変異体、ugt74d変異体などのオーキシン不活性化経路の変異体について、その感受性試験を実施した。（２）GH3やDAO1不活性化酵素の欠失変異株・過剰発現体の作成を実施した。GH3の過剰発現体・多重欠損変異株および、GH3酵素によって合成されるIAAアミノ酸複合体を加水分解しIAAを遊離するILR1/ILL酵素の過剰発現体・多重欠損変異株の作成に着手した。過剰発現ベクターについては問題なく構築でき形質転換したが、恒常的な過剰発現体では、表現型の異常が極めて強いため、薬剤誘導性の過剰変異体を作製した。一方、欠失変異体については、カルフォルニア大学との共同研究で、ゲノム編集による欠失を実施した。現在、形質転換体・欠失変異体の作成は計画通り進行している。（３）シロイヌナズナのGH3やDAO1不活性化酵素を低温誘導性発現ベクターpCold1に導入し、大腸菌で組換え酵素として発現させることに成功したので、各酵素の基礎的なカイネテッィクや基質特性を解析中であり、計画通り進行している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、（１）「GH3酵素阻害剤・IAA-アミノ酸誘導体の評価」：GH3酵素阻害剤・IAA-アミノ酸誘導体で処理した野生株、変異株のIAA代謝中間体の精密測定を実施し、表現型と代謝中間体の蓄積量の関連を分析し、代謝物フローを見積もる。（２）「不活性化酵素の欠失変異株・過剰発現体の作成と代謝中間体の精密定量」：本年度作成中のGH3・DAO活性化酵素の欠失変異株・過剰発現体とILR1・ILL酵素の欠失変異株・過剰発現体のホモ個体と表現型の詳細な解析を実施して、その後にそれら欠失変異株・過剰発現体中のIAA代謝中間体のLC-MS/MSによる精密定量を行う。また、安定同位体の投与実験も試みる。（３）「不活性化酵素の機能解析」：シロイヌナズナのGH3やDAO1不活性化酵素に加えて、ILL1-ILL6およびILR1,IAR3代謝酵素について組換え酵素について調製を試みる。本年度実施した予備的な検討では、大腸菌での発現は困難であると見積もったので、無細胞タンパク合成系など、別の発現系での酵素タンパク質の調製を目指す。
|
Research Products
(9 results)
-
-
-
-
[Journal Article] Pinstatic Acid Promotes Auxin Transport by Inhibiting PIN Internalization.2019
Author(s)
Oochi A, Hajny J, Fukui K, Nakao Y, Gallei M, Quareshy M, Takahashi K, Kinoshita T, Harborough SR, Kepinski S, Kasahara H, Napier R, Friml J, Hayashi KI
-
Journal Title
Plant Physiol.
Volume: 180
Pages: 1152-1165
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
-
-
-
-
