2019 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive understanding of refilling mechanism of excitatory neurotransmitter glutamate into synaptic vesicles
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19H03330
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
高森 茂雄 同志社大学, 脳科学研究科, 教授 (10397002)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 神経伝達物質・受容体 / シナプス小胞 / シナプス伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類脳神経系における興奮性シナプス伝達は、シナプス小胞からのグルタミン酸の活動依存的な放出によって支えられている。本研究課題では、グルタミン酸のシナプス小胞への再充填を司る小胞型グルタミン酸トランスポーター（VGLUT）に焦点をあて、再充填メカニズムの解明、発現量やイソ型とシナプス伝達特性の解明、VGLUTタンパク質のシナプス小胞への回収機構の解明、に取り組んでいる。本年度は、以下の成果を得た。
（１）VGLUT1欠損マウスの聴覚系巨大シナプスの電気生理学的な特性を明らかにした。海馬・線条体などはVGLUT1かVGLUT2のいずれかを優位に発現しているのに対して、当該シナプスはVGLUT1とVGLUT2の両方を発現している。本年度は、VGLUT1欠損は、evoked EPSC, miniature EPSCや短期シナプス抑圧については大きな差異を示さないが、小胞への充填速度が野生型の25％程度に低下することを見出した。また、100 Hzで連続した際にVGLUT1欠損シナプスは有意に高いシナプス不全を呈することを新たに見出した。
（２）クラスリン非依存的なエンドサイトーシスが起きる条件において、VGLUT1-C末に存在してAP2を介してクラスリンへの間接的な結合を担うと目されているDi-leucineモチーフの役割を、pHluorinを用いた蛍光イメージング法を用いて解析した。興味深いことに、AP-2との結合能を減弱させたVGLUT1変異体は、クラスリン非依存的なエンドサイトーシス時においても、その回収が顕著に遅くなった。また、AP-2欠損ニューロンにおいてもVGLUT1の回収が遅くなった。VGLUT1以外のタンパク質についても同様の解析を行った結果、AP-2には積荷タンパク質選択的かつクラスリン非依存的に小胞タンパク質の回収効率を制御している可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度計画していた研究項目について、順調に研究成果を積み重ね、上記（１）は学術雑誌に投稿済みで、現在リバイスのための実験を行なっている(Cell Rep, under revision)。上記（２）については、海外共同研究者（Volker Haucke, FMP-Berlin）との調整を進めており、次年度中の論文投稿の算段である。一方、研究項目として掲げていた単一シナプスにおけるグルタミン酸イメージングや新しい蛍光プローブ開発についても、実験系の確立に一定の目処が立っており、次年度への発展が見込まれる。以上のように、本研究計画はおおむね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の通り、本研究計画で推進している各研究項目で成果が蓄積しており、次年度も継続していく。上記の二つの研究項目は、既に投稿段階にあるため、次年度中の論文掲載を目指して進める。新規蛍光プローブの開発については、オリゴDNAを利用したナノプローブ作成を試作し、pHプローブを搭載したプローブによるシナプス小胞膜イメージングの実用性を検証する。それが実用可能であれば、当初計画していたClプローブへの応用を試みる。単一シナプスグルタミン酸イメージングについては、データ取得の目処は立っているので、VGLUT1欠損ニューロンでの解析に移行するとともに、データ解析法の確立も同時に進める。
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