Regulatory mechanisms underlying neuronal dynamic: Lipid-mediated signals from internal membrane to plasma membrane

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03332
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 上口 裕之 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, チームリーダー (10233933)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 成長円錐 / エキソサイトーシス / ホスファチジン酸

Outline of Annual Research Achievements

神経回路構築に重要な軸索ダイナミクスは、軸索先端部（成長円錐）における細胞内膜小胞の方向選択的な輸送と形質膜との融合（エキソサイトーシス）によって制御される。本研究では、軸索ダイナミクスを制御する脂質シグナルを同定し、そのシグナルが形質膜局所での膜小胞エキソサイトーシスと成長円錐の先導端突出を促進する機序を明らかにすることを目指す。研究代表者らの2019年度の研究により、成長円錐の形質膜の内葉（脂質二重層の細胞質側）で産生される脂質ホスファチジン酸が、VAMP2（膜融合に関わるSNAREタンパク質）を含む膜小胞のエキソサイトーシスならびに軸索の誘引性旋回応答に必要であること示す確実なデータが得られた。また、薬理学的阻害実験およびRNA干渉法を組み合わせた実験を行い、成長円錐の誘引性旋回応答過程でのホスファチジン酸合成が脂質代謝酵素ホスホリパーゼDに依存することを示し、VAMP２陽性膜小胞と共局在するホスホリパーゼDアイソフォームを同定した。細胞外ガイダンス分子によって旋回誘導された成長円錐を用いて、VAMP２陽性膜小胞が先導端形質膜に接触する前後で、形質膜内葉のホスファチジン酸量の変化を可視化解析することを試みた。蛍光タンパク質を付加したホスファチジン酸結合ペプチドを細胞質に発現する成長円錐をエバネッセント顕微鏡で観察することで、形質膜内葉のホスファチジン酸の空間ダイナミクスの定量に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2019年度の交付申請書に記載した研究課題を全て完了した。

Strategy for Future Research Activity

① 膜小胞の脂質代謝酵素が形質膜脂質へ及ぼす影響の可視化解析
誘引性ガイダンス分子によって旋回誘導されつつある成長円錐を用いて、VAMP２陽性膜小胞が先導端形質膜に接触する前後で、形質膜内葉におけるホスファチジン酸をエバネッセント顕微鏡で可視化解析し、膜小胞輸送とホスファチジン酸量の時空間的な相関関係を明らかにする。
② 形質膜脂質代謝が軸索ダイナミクスを制御する分子メカニズムの解明
VAMP２陽性膜小胞が形質膜脂質代謝を促進して、エキソサイトーシスが可能な状態に形質膜を変化させる可能性を検証する。膜小胞－形質膜接触部位でのホスファチジン酸合成に続いて、当該膜小胞と形質膜の融合（エキソサイトーシス）が起こるか否かを明らかにする。エキソサイトーシスの可視化には、VAMP２の膜小胞内腔側にpH感受性蛍光タンパク質を付加したコンストラクトを用いる。膜融合を担うSNAREタンパク質のうち標的膜に存在するシンタキシン1Aは酸性リン脂質結合ドメインを有するため、シンタキシン1Aとホスファチジン酸との結合を検証するとともに、膜小胞依存的に脂質代謝が変化した形質膜領域にシンタキシン1Aが集積してSNARE依存的膜融合が誘起されるか否かを、各種イメージング技術を駆使して定量的に解析する。以上、膜小胞が惹起する形質膜脂質代謝がエキソサイトーシスを引き起こす仕組みを明らかにし、軸索ガイダンスを駆動する新規脂質シグナルを同定する。

Research Products

• [Journal Article] Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor Type 3 Regulates Neuronal Growth Cone Sensitivity to Guidance Signals (2020)
  • Author(s): Carmen Chan, Noriko Ooashi, Hiroki Akiyama, Tetsuko Fukuda, Mariko Inoue, Toru Matsu-ura, Tomomi Shimogori, Katsuhiko Mikoshiba, Hiroyuki Kamiguchi
  • Journal Title: iScience Volume: 23 Pages: 100963
  • DOI: 10.1016/j.isci.2020.100963
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor Type 3 Regulates Neuronal Growth Cone Sensitivity to Guidance Signals (2019)
  • Author(s): Ooashi N, Chan C, Akiyama H, Matsuura T, Shimogori T, Mikoshiba K, Kamiguchi H
  • Organizer: The 42nd Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society and The 62nd Annual Meeting of the Japanese Society for Neurochemistry
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Functional analysis of phospholipid metabolites in axon guidance (2019)
  • Author(s): Hida T, Mori T, Kamiguchi H
  • Organizer: The 42nd Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society and The 62nd Annual Meeting of the Japanese Society for Neurochemistry
  • Int'l Joint Research