2020 Fiscal Year Annual Research Report
A novel therapeutic strategy for ischemic stroke based on the activity-dependent transcription factor Npas4
| Project/Area Number |
19H03340
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
坪井 昭夫 大阪大学, 生命機能研究科, 特任教授 (20163868)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 弘雄 香川大学, 医学部, 講師 (20390685)
森 英一朗 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70803659)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 脳血管障害 / 神経活動依存性 / 神経保護 / 転写因子Npas4 / 神経可塑性 / 治療法開発 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、脳梗塞の発症初期にNpas4がニューロンの細胞死を抑制し生存を促進する内在性の分子機構を解明する共に、その革新的な治療法の開発に繋げる。
A）脳梗塞により発現するNpas4に関する初代培養細胞を用いた解析
B）脳梗塞により発現するNpas4の標的遺伝子の同定：脳梗塞による虚血時の際に、転写因子Npas4は神経細胞の生存に必須な因子であるが、転写因子をターゲットとした創薬はその作用点が多岐にわたる可能性が懸念された。そこで、脳梗塞モデルマウスを用いて、脳梗塞手術後に、梗塞巣の境界領域で発現が変化する遺伝子群（200個）の中から、Npas4の下流で働く遺伝子を、RNAシークエンシングにより探索した結果、15個の候補遺伝子が得られた。15個の各々の候補遺伝子を強制発現させた後に、マウス初代培養ニューロンに虚血様負荷を与えた時に、細胞死を減少させるものを探した。その結果、Npas4の下流遺伝子のGemを同定することに成功した。そこで現在、Gemノックアウトマウスを作製し、脳梗塞手術を行い、梗塞巣のサイズを調べている。
C）Npas4関連因子を用いた脳梗塞の治療法の開発
D)ヒトiPS細胞由来の脳オルガノイドを用いた解析：「マウスの脳梗塞におけるNpas4の機能がヒトにも敷衍できるのか？」が治療法の開発に際して重要な鍵となる。研究分担者の森英一朗は、ヒトiPS細胞を単一の細胞ではなく、複数の細胞からなるオルガノイド（臓器様細胞塊）に分化させることを試み、最近、三次元培養系を駆使して、大脳皮質オルガノイドに分化させることに成功した。そこで、ヒト脳オルガノイドに虚血様負荷を与えた場合に、マウス初代培養ニューロンと同様に、Npas4遺伝子の発現誘導が起こるかどうかを調べた。その結果、ヒト脳オルガノイドにおいて、Npas4のヒトオーソログ遺伝子が誘導されることがわかった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
私共は、Npas4の下流遺伝子であるGemを同定することに成功した。in vitroにおいて、野生型マウス由来の初代培養ニューロンでGemを過剰発現させた後に、虚血様負荷を与えると、神経細胞死は顕著に減少することが明らかになった。
そこで次に、in vivoでのGemの機能を明らかにするために、その遺伝子欠損マウスの作製にとりかかった。Gem欠損マウスにおいて、germline transmissionには成功したが、ヘテロ欠損マウスの雄と雌を交配した際に、ホモ欠損マウスが非常に生まれにくいことがわかった。本研究遂行上、Gemホモ欠損マウスは必要不可欠であるので、その作製を継続して行っている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
C）Npas4関連因子を用いた脳梗塞の治療法の開発
in vitroでの初代培養ニューロンを用いた解析では、Npas4やGem遺伝子の過剰発現により、ニューロンの細胞死が抑制されることがわかった。そこで次に、in vivoでのNpas4やGemの機能を明らかにするために、アデノ随伴ウイルスを用いて、仔マウスの脳に、Npas4またはGem遺伝子を導入する。その後、成体マウスに対して脳梗塞手術を行い、これらの遺伝子の過剰発現による治療効果の有無を検討する。新生仔の脳室にアデノ随伴ウイルスを注入すると、ウイルスが大脳皮質に漏れて広く感染することが報告されている。そこで、日置寛之博士が開発したSynapsin promoterとTet-Off promoterを組み合わせたアデノ随伴ウイルスベクターを仔マウスの脳に感染させて、マウスが成体になった時に、ニューロン特異的にNpas4やGem遺伝子を発現させる。そして、脳梗塞手術後の梗塞巣のサイズを測定する。
D)ヒトiPS細胞由来の脳オルガノイドを用いた解析
「マウスの脳梗塞におけるGemの機能がヒトにも敷衍できるのか？」が治療法の開発に際して重要な鍵となる。そこで本研究では、ヒト脳オルガノイドに虚血様負荷を与えた場合に、Npas4と同様に、その下流遺伝子Gemの発現誘導が起こるかどうかを調べる。
|
