2019 Fiscal Year Annual Research Report
Involvement of inter-organelle Ca2+ network in developement of deseases caused by smooth muscle remoedeling
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19H03381
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鈴木 良明 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (80707555)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Ca2＋シグナル / カベオラ / 平滑筋細胞 / オルガネラ / リモデリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）血管平滑筋細胞（VSMC）の興奮転写連関（E-T カップリング）に関与するCaMKファミリーの同定：①siRNAを用いて、平滑筋細胞株のE-Tカップリングに対する、各CaMKファミリー分子の寄与を調べた。その結果、CaMKK2が主要因子であることが示唆された。②他大学との共同研究によりCaMKK2-KOマウスを樹立中である。KO確認次第、細胞～個体レベルの実験を行う。
2）同定されたCaMKファミリー分子とカベオリン（Cav）-1との相互作用の解明：①全反射蛍光顕微鏡による1分子可視化解析を行ったところ、CaMKK2はL型電位依存Ca2+チャネル（VDCC）やCav1と共局在していた。さらにPLA法による解析から、CaMKK2は上記の分子とごく近傍に存在することが明らかになった。CaMKK2はカベオラを足場としてVDCCと分子複合体を形成すると考えられる。②マウス腸間膜動脈のcDNAより各CaMKファミリーの遺伝子をクローニングし、これらの蛍光タンパク質標識体を作製した。ウイルスベクターを作製し、ライブセルイメージングを計画中である。
3）E-TカップリングによってVSMCで発現誘導される遺伝子の解明：脱分極刺激誘発性のE-T カップリングがどのような遺伝子発現を起こすのかは不明であった。そこで、RNAseq解析により、脱分極刺激によって誘導される遺伝子を網羅的に解析した。その結果、白血球接着因子やサイトカイン、基質分解酵素など血管リモデリング形成促進遺伝子群の発現上昇が明らかになった。
4）E-Tカップリングと平滑筋リモデリング疾患の関係性の解明：生体内で持続的な脱分極を引き起こす刺激として圧負荷が考えられる。そこでマウス腸間膜動脈標本に対して、正常血圧および高血圧を想定した圧負荷を与えた。その結果、高圧負荷により、脱分極刺激と同様にCREBリン酸化が引き起こされ、VDCCやCaMK阻害薬によって有意に抑制された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平滑筋E-Tカップリングの重要な因子としてCav1とCaMKK2を明らかにし、イメージング解析により両者の分子間相互作用が判明した。これらの結果を踏まえて、CaMKK2-KOマウスの作製が進行中である。また、RNAseq解析より平滑筋E-Tカップリングにより誘導される遺伝子が明らかになった。E-Tカップリングが、持続的な力学的あるいはアゴニスト負荷による代償機構とそれに続くリモデリング疾患につながることを示唆する興味深い結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）VSMCのE-T カップリングに関与するCaMKファミリーの同定：CaMKK2-KOマウス由来の血管組織を用いて、①CaMKK2のKO確認、②脱分極誘発性E-T カップリングの変化を解析する。CaMKK2の下流分子として、CaMKI、CaMKIVが関与する可能性がある。そこで、③各分子のリン酸化抗体を用いた活性測定、④siRNAによるノックダウン、あるいはKOマウスにより、それぞれの役割を明らかにする。
2）同定されたCaMKファミリー分子とCav-1との相互作用の解明：CaMKK2はカベオラに局在することで、VDCCあるいはRyR由来のCa2+によって効率的に活性化されると仮定した。その検証のため、①蛍光タンパク質やgene-encoded Ca2+ indicatorで標識したCaMKK2をウイルスベクターによりmMASMCに発現させて、カベオラ内CaMKK2近傍のCa2+濃度を全反射蛍光顕微鏡で計測する。②下流CaMKのカベオラ局在化の有無の検証を行う。③細胞内Ca2+濃度上昇に伴うCaMKK-CaMKI/IV分子の経時的局在変化を可視化する。以上の実験により、オルガネラゾーンによるCaMKK-CaMKI/IV分子の局在・活性の時空間的制御を明らかにする。
3）E-TカップリングによってVSMCで発現誘導される遺伝子の解明：カベオラおよびCaMKK2がどの血管リモデリング形成促進遺伝子群発現に関与するかCav1-KO、CaMKK2-KO、および各種阻害薬を用いて同定する。
4）E-Tカップリングと平滑筋リモデリング疾患の関係性の解明：①血管内灌流圧の上昇でもE-T couplingが誘発された。そこで頸動脈結紮モデルを作製して、圧負荷によって引き起こされる頸動脈リモデリングに対するE-T couplingの関与を明らかにする。②低酸素性肺高血圧マウスに対して①と同様の実験を行い、肺高血圧症に対するE-Tカップリングの影響を明らかにする。
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