2019 Fiscal Year Annual Research Report
Integrated analysis of atypical glycosylation as a basis for precise regulation of Notch signaling in the vascular endothelium
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19H03416
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
岡島 徹也 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (20420383)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小川 光貴 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (70727429)
竹内 英之 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80361608)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Notch1 / EOGT / O-GlcNAc |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(１) Notch受容体の非典型糖鎖の包括的構造解析（担当：岡島・竹内・小川）
前年度において、Notch1の細胞外ドメインをHEK293T細胞に発現させ、FLAG抗体を用いて精製した後に、プロテアーゼ消化産物のOrbitrapFusionを用いた質量分析をすることで、O-GlcNAc糖鎖分析に成功し、この手法を、Hela、Caco2、MCF-7に適用することで、Notch1糖ペプチドの前駆イオンとフラグメントイオンの全プロファイルを作成した。その結果、フコースを含む新規のO-GlcNAc糖鎖の存在を示唆するデータが得られており、Notchシグナルの精密制御に関わる候補の１つとして考えられた。本年度も引き続き、質量分析による定性・定量分析システムを用いて、新規糖鎖構造の決定と合成に関与するフコース転移酵素を同定することを予定している。
(２) Notch受容体糖鎖の生体内情報の分析を実現する手法の確立（担当：岡島）
前年度までに、非典型糖鎖の包括的構造解析をマウスレベルで解析するために、Notch1糖鎖レポーターコンストラクトを有するトランスジェニックマウスを作製した。トランスジーンの確認をゲノムPCRによって実施した。今年度も引き続き、このマウスを血管内皮特異的にCreを発現するTie2-Creマウスと交配し、さらに、Rosa26-CAGG-LSL-rtTA3マウスと交配させ、Cre陽性の血管内皮において遺伝子組換えが生じ、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA3)の遺伝子発現が誘導され、テトラサイクリン誘導体のドキシサイクリン(Dox)投与時に、FLAG-Notch1が発現誘導されることを確認する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Notch1の構造解析とNotchレポーターマウスの実験について、想定されていない問題も生じておらず、今後の研究計画が順調に進展することが見込めるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の研究計画を継続するのに加えて、本年度は新たに、Notch受容体糖鎖によるNotchシグナル強度の制御機構の解析を進める。脳血管内皮に発現する特徴的な糖鎖構造によって媒介されるNotchシグナル強度を明らかにするために、同定された糖鎖構造に対応する糖転移酵素遺伝子について、レンチウイルスを用いたゲノム編集を行う。糖鎖構造を改変した細胞株における糖鎖構造変化の確認と同時に、定常時とリガンド刺激時におけるHES1やHEY1などのNotchシグナル標的遺伝子の発現レベルを測定し、Canonical経路の活性化を定量的に評価し、Notch受容体糖鎖の多様性とNotchシグナル強度の相関性を明らかにする。
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