2020 Fiscal Year Annual Research Report
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19H03418
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山本 拓也 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (60546993)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 多能性幹細胞 / RNA2次構造 / 転写後修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、多能性幹細胞特異的なmRNAの2次構造を同定し、その構造がどのように制御され、どのようにタンパク質の発現制御に関連するのかを統合的に解析し（RNAレギュローム）、mRNAの「質」的制御が細胞機能に及ぼす影響を解明することである。昨年度までに、細胞内でのmRNAの2次構造を同定するため、DMS-MaPseq法を複数のヒト多能性幹細胞株(iPS細胞、ES細胞)やヒトiPS細胞のもととなった体細胞に適用できるように実験条件の最適化を行い、解析を実施した。その結果、複数の遺伝子の非翻訳領域に多能性幹細胞特異的なRNA2次構造が存在し、その構造がタンパク質翻訳へ影響を与える可能性があることを示唆するデータを得た。本年度は、マウスの細胞を用いたRNAの2次構造データも取得した。さらに、昨年度に見出したヒト多能性幹細胞においてタンパク質翻訳へ影響を与える可能性があるRNAの2次構造をより高精度で解析するため、分子バーコード（UMI: Unique Molecular Identifier）を利用したターゲットシーケンシング法を確立した。この手法を用いることによって、5'非翻訳領域、3’非翻訳領域等のRNA2次構造をスプライシングバリアントを区別しながら高精度で解析することが可能となった。また、それらデータを効果的に用いて、RNA2次構造を決定するバイオインフォマティクス手法も開発した。本手法を適用させた解析により、体細胞初期化におけるRNA2次構造の変化は、多能性幹細胞特異的な転写開始点やスプライシング制御と密接に関連することが示唆された。また、多能性幹細胞特異的なRNA2次構造に、複数のRNA結合タンパク質の結合保存配列が存在することも明らかとなった。本研究は、転写後RNA制御ネットワーク機構が多能性維持機構に関わることを示すものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、分子バーコードを利用したターゲットシーケンシングによるDMS-MaPseqの改良手法を確立し、特定のRNAの2次構造をより高精度で明らかにすることに成功し、転写開始点やスプライシング制御機構との関連性も明らかにすることができた。また、多能性幹細胞特異的なRNA2次構造を制御する候補RNA結合タンパク質も同定することができており、当初の目標をおおむね達成できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、翻訳効率に影響を与えるRNAの2次構造を塩基単位で決定するため、さまざまな変異を導入したレポータコンストラクトを用いて、詳細に検討する。さらに、すでに同定しているRNA2次構造を制御しうる候補RNA結合タンパク質の機能解析を実施し、RNA2次構造制御機構と多能性維持機構の詳細な分子メカニズムに迫る。また、既に取得済みのマウスのRNA2次構造と比較解析により、RNA2次構造の種を超えた保存性についても検討する。
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