2020 Fiscal Year Annual Research Report
ユビキチン・リガーゼを介する神経回路形成とエネルギー代謝の調節機構
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19H03422
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
豊福 利彦 大阪大学, 医学系研究科, 特任教授(常勤) (60322179)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア輸送 / LRRK2 / パーキンソン病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアの代謝異常は神経疾患特にパーキンソン病の病態と関わっている。申請者らはミトコンドリア機能調節を担うミトコンドリア・ユビキチン・リガーゼがパーキンソン病の原因遺伝子であるLRRK2により制御されることを見出した。本年度はミトコンドリアの神経軸索内移動の動作メカニズムを検討した。
神経細胞としてPC12細胞株を用いた。この細胞は低用量FBS培養液中で神経細胞類似の神経突起を発現し、その軸索内のミトコンドリアそのほかの細胞小器官の輸送を共焦点レーザー顕微鏡にて解析することが可能である。LRRK2(G2019S)発現PC12細胞、LRRK2欠損PC細胞を樹立して以下の解析を行った。
（Ａ）ミトコンドリア神経軸索内移動の検討：（Ａ－１）mito-GFPをPC12細胞に遺伝子導入してミトコンドリア移動を停止・移動の比率、移動速度の測定： LRRK2(G2019S)活性型細胞では神経内でのミトコンドリアの移動量の抑制が起きた。速度は一定。LRRK2(G2019S)欠損細胞では神経内ミトコンドリア移動量の増加が起きた。速度は一定（Ａ－２）神経軸索内での小胞体―ミトコンドリア間のタンパク質間結合の評価：Proximity ligation 法を用いる。小胞体に局在するIP3受容体とミトコンドリアに局在するVDACの蛋白質間結合により小胞体―ミトコンドリア間結合を評価する。LRRK2(G2019S)活性型細胞では結合の増加が起きた。その程度は移動ミトコンドリア量と相関があり、小胞体―ミトコンドリア間結合が移動するしないの決定に重要と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ミトコンドリアは細胞内代謝とりわけエネルギー産生における中心的器官である。定常状態でのエネルギー産生に加え、飢餓状態ではオートファジーによる自己消化作用で細胞内物質の再利用により細胞機能の維持を行い、再生不能状態ではアポトーシス（細胞死）により細胞の除去を行う。このように細胞の運命決定機構としても重要な役割のあるミトコンドリアは多くの疾患とりわけ神経変性疾患において、その機能異常と病態の関連が報告されてきている。申請者らはパーキンソン病の病態にミトコンドリア・ユビキチン・リガーゼ活性の過剰増加によるエネルギー代謝の低下を見出した。神経細胞では神経突起の形成・維持にミトコンドリアの輸送がエネルギー供給に重要である。今回、LRRK2が神経軸索内ミトコンドリア輸送を制御することを明らかにすることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
パーキンソン病は原因遺伝子であるLRRK2のキナーゼ活性部位の変異し活性の亢進したLRRK2(G2019S)により発症する。今回の研究でLRRK2(G2019S)の神経軸索内ミトコンドリア輸送に対する抑制効果を確認した。今後は以下の生化学的解析を行う。
（A）ミトコンドリア代謝能の検討： 生化学的解析は培養細胞よりミトコンドリアを分離精製し、電子伝達系を構成するcomplex I, IV活性を測定する。 さらにATP濃度はd-luciferinを使用した測定キット（Molecular Probe社）にて測定する。
（B）ユビキチン・リガーゼとの連関について検討： 以前にLRRK2とユビキチン・リガーゼとの機能連関について見出した。神経軸索内で、ミトコンドリア輸送の抑制メカニズムにこのキナーゼの関与の有無を検討する。 精製したユビキチン・リガーゼと候補分子を混合し、UbcH7存在下でインキュベートする。ユビキチン化された候補物質はＳＤＳ－ＰＡＧＥにて展開し、抗ユビキチン抗体にて検出する。ゲルより切り出された候補分子はLC-MAS法によりそのアミノ酸組成を解析し、分子を同定する。
今後、LRRK2(G2019S)によるパーキンソン病の治療にLRRK2抑制物質のスクリーニングを行いパーキンソン病の治療応用を行いたい。
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