2020 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of G protein/Arrestin-GPCR complex for development of biased ligands
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19H03428
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
寿野 良二 関西医科大学, 医学部, 講師 (60447521)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斉藤 毅 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (80609933)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡単粒子解析 / X線結晶構造解析 / GPCR / バイアスドリガンド / シグナル伝達 / 創薬 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【目的】
創薬ターゲットとして知られているGタンパク質共役受容体（GPCR)は細胞外からの生理活性物質と結合すると細胞内の種々のシグナル伝達因子（Gタンパク質やアレスチン、キナーゼなど）を活性化する。Gタンパク質とアレスチンの異なるシグナル伝達経路の一方を選択的に活性化するリガンド（バイアスドリガンド）は、副作用のない治療薬として期待されている。一方で、バイアスドリガンドの開発には膨大な化合物スクリーニングの労力を要しており、効率的な薬剤開発技術が求められている。本研究では、GPCR（オレキシン2受容体（OX2R)およびプロスタグランジンE2受容体EP3とGタンパク質あるいはアレスチンとの複合体、作動薬結合状態構造のX線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡単粒子解析（Cryo-EM SPA)を行う。本研究ではGPCR－Gタンパク質およびアレスチン複合体構造を比較した情報をもとに、迅速で合理的なバイアスドリガンドの開発とその技術の発展に貢献する。
【研究実績】
・OX2R/EP3-Gタンパク質複合体のCryo-EM SPA
数種類あるGタンパク質のうち、OX2R,EP3それぞれと最も安定な複合体を形成する条件を選別する。EP3-GiおよびGo,G１３複合体、OX２R-Gi/o複合体について条件検討を重ね、安定な複合体条件を見出しており、EP3-GiについてはCryo-EM SPにより３．４A分解能で構造決定できた。我々のグループでは別のサブタイプEP４-Gタンパク質との複合体構造も決定しており、Gタンパク質の種類が異なることからプロスタグランジン受容体のGタンパク質選択性の構造基盤について議論した論文の投稿準備中である。
その他、GPCR-アレスチン受容体複合体構造解析に向けて必要なコンポーネントの生産および安定な複合体形成条件検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GPCRとシグナル伝達因子複合体の構造解析を通じてバイアスドリガンドを設計することを目的として、OX2R,EP3受容体を用いた構造解析を進めている。課題申請の内容どおり、EP3-Gi複合体の構造を３．４A分解能で決定でき、Gタンパク質とEP3の結合状態を明らかにすることができた。また、他のプロジェクトで構造決定に成功したEP4-Gs複合体構造と比較することにより、新たにプロスタグランジン受容体のGタンパク質選択性についても構造生物学的に明らかにできたことは予想外の成果である。同時にGoとの複合体の構造解析を進めており、課題申請内容に加えてEP3-Go構造決定も現実的になってきた。一方で、EP3-G13複合体については複合体は形成できたものの、構造解析レベルのデータが得られなかった。また、OX2Rについては我々が目指していたGタンパク質複合体構造を2021年になってメルクのグループが報告したため、こちらを参考にしてプロジェクトのストラテジーを軌道修正し、より迅速に構造決定する方針に変更する。現在までの、我々はOX2R-GiおよびGq/11の複合体形成には成功しているものの構造決定までに至っていない。EP3およびOX2R-アレスチン複合体については受容体、キナーゼ、アレスチンなどのコンポーネントが準備でき、現在までに受容体のリン酸化、複合体形成条件の検討を進めており、課題申請の内容のスケジュールどおりの予定で進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
【GPCR-Gタンパク質複合体の構造解析】
近年のCryo-EM SPAの技術革新によりGPCR複合体の構造解析の研究は世界的に高速化している。EP3-Gi/o複合体構造決定に成功したので、この経験、技術を生かしてOX2R-Gタンパク質複合体についても迅速な構造決定を目指す。メルクのグループが既に成功しているが、我々は研究分担者である筑波大学 斎藤らが独自に開発したナルコレプシー治療薬を使った構造決定を通じて、メルクのリガンドとの作用機序の違いを構造生物学的に明らかにすることを目的とする。世界的な研究環境の変化から、作動薬結合型OX2RのX線結晶構造解析およびGタンパク質複合体構造解析は、メルクのグループのストラテジーも参考にしてに集約したプロジェクトとして方針を変更し、期間内でのナルコレプシー治療薬候補結合型構造の決定を目指す。EP3-G12/13複合体の構造解析についてはEP3が数多くのVariantがあることからこれらの中から最も複合体が安定なものを選別する。
【GPCR-アレスチン複合体構造像解析】
受容体やキナーゼ、アレスチンの精製に成功し、現在までに複合体形成条件を検討してきた。今後は筑波大学が開発したナルコレプシー治療薬候補を利用した受容体のリン酸化条件の検討、構造解析可能なさらなる安定な複合体形成条件の検討を通じて、Cryo-EM SPAを行う。
【バイアスドリガンドの合成と薬理学的評価】
OX2Rについては上述の情報を研究分担者 筑波大学 斎藤らにフィードバックし、新規構造の化合物合成、薬理学的解析、マウスを用いた胴体などの実験を行い、より選択性が高く、副作用の少ないバイアスドリガンドの創出を目指す。EP3についてはBINDSの支援事業を利用して、化合物合成を行う。
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