2019 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of the mechanisms of RAMA on secretory protein trafficking in sporozoites
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19H03459
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
石野 智子 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40402680)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橘 真由美 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (00301325)
馬場 みなみ 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 研究員 (00814906)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マラリア原虫 / スポロゾイト / ロプトリー / タンパク質輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マラリア原虫の侵入型であるスポロゾイトとメロゾイトの先端部には、共通してロプトリーとマイクロネームと呼ばれる分泌タンパク質を内包する小器官が認められる。特にロプトリータンパク質は、メロゾイトの赤血球侵入に際して、分泌されて密着接合の形成に関わることで侵入に重要な役割を担うと報告されている。本課題は、スポロゾイトにおいてロプトリーに局在し、スポロゾイトの蚊の唾液腺への侵入に重要な役割を担うことを見出したRAMAに着目し、その作用機序の解明からロプトリーへのタンパク質輸送／分泌のメカニズムを明らかにすることを目的とする。
本年度は、スポロゾイト時期特異的RAMA発現抑制ネズミマラリア原虫 (RAMA-cKD) のスポロゾイトを用いて、他のロプトリータンパク質の局在を免疫電顕法により解析した。抗体の特異性が十分でないRON5、RALP1等については、RAMA-cKD原虫にさらに標的タンパク質のC末端側にc-Mycを融合させたRON5-cMyc, RALP1-cMyc等を発現させた遺伝子改変原虫を新たに作出した。免疫電子顕微鏡観察の結果、ロプトリータンパク質群を、ロプトリーへの輸送にRAMAが必須か否かにより２つのグループに分類した。
RAMAのどの領域が、他のロプトリー分子との相互作用に必要かを免疫沈降法により解析するための、RAMA-full, RAMA-repeat, RAMA-P40の組換えタンパク質の合成を行なった。スポロゾイト、メロゾイトそれぞれ用いて、免疫沈降法の実験系を確立した。
また、それぞれの領域が機能にどのように関わるのかを解析するために、RAMA-cKD原虫にRAMA-full, RAMA-repeat, RAMA-P40および、RAMAの切断予想部位を全て改変したものを導入するためのコンストラクトを作出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画書と一部順番を変えたところはあるが、RAMAの他のタンパク質のロプトリーへの輸送に対する影響を電子顕微鏡レベルで解析できたこと、構造活性相関を見るための、遺伝子改変原虫作出用コンストラクト（一部の組換え原虫は作出済み）が構築されたこと、免疫沈降法による相互作用解析の準備が整ったことから、本課題遂行に向けての準備が整ったと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、まずは必要な遺伝子改変原虫を全て作出する。すなわち、RAMA-cKD原虫に、野生型／改変型のRAMAを発現させたものを、合計４種類作成する。このことにより、RAMAのN末側のrepeat領域、C末側のP40、さらにrepeat領域が切断されること、それぞれがRAMAのタンパク質のロプトリーへの輸送、さらにはスポロゾイトの唾液腺侵入にどのように関わるのか、表現型の解析を行う。
さらに、免疫沈降法を用いて、RAMAのどの領域が他のロプトリータンパク質との相互作用に関わるのか明らかにする。
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