2020 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of the mechanisms of RAMA on secretory protein trafficking in sporozoites
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19H03459
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
石野 智子 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40402680)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橘 真由美 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (00301325)
馬場 みなみ 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 研究員 (00814906)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マラリア / スポロゾイト / ロプトリー / タンパク質輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マラリア原虫の標的細胞侵入機構の主要部分を担うロプトリータンパク質群の作用機序を解明することを目標とし、ロプトリーの膜上に局在するGPIアンカー型膜タンパク質であり 、スポロゾイトの唾液腺侵入に重要な役割を担うRAMAに着目した。すでに、スポロゾイト時期特異的にRAMAの発現を抑制した遺伝子改変原虫(RAMA-cKD)作出により、RAMAがスポロゾイトの唾液腺への侵入に重要であることを明らかにしている。
今年度はさらに、切断されるRAMAのN末側の繰り返し配列領域、および成熟型と考えられるC末側のP40領域を欠損させたRAMA発現コンストラクトを、RAMA-cKD原虫に導入することで、それぞれの領域の機能を解析した。コントロールとして、full lengthのRAMAを発現させた時に、RAMA-cKDの形質は全てレスキューされた。繰り返し配列を欠いたRAMA発現原虫は得られたが、P40領域を欠損させたRAMAの発現原虫は単離できず、赤血球への感染が抑制されたためと考え、スポロゾイト特異的なプロモーターであるcspプロモーターを用いて新たな組換え原虫を作出した。なお、cspプロモーターに繋いだfull lengthのRAMAは、rama プロモーターのものに比べて中腸スポロゾイトにおける転写量は10倍程度増強された一方で、スポロゾイトの唾液腺への侵入効率は半分程度に抑制された。適切な量あるいはタイミングでのRAMAの転写が、正常なスポロゾイト形成に重要な役割を持つことが示唆される。
繰り返し領域を欠いたもの、P40領域を欠いたもの両方ともが、唾液腺への侵入が大きく抑制されることを見出し、いずれの領域もRAMAの機能に重要であることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子改変原虫の作出およびその解析が順調に実施できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
RAMAの繰り返し領域の機能を明らかにするために、RAMA-cKDに繰り返し領域を欠いたRAMAを発現させた原虫のスポロゾイトにおける、RAMAおよび他のロプトリータンパク質の局在およびタンパク質量を、免疫電顕法とwestern blottingにより解析する。影響があったロプトリータンパク質について、full length RAMAあるいは、繰り返し領域と相互作用するのか、免疫沈降法などを用いて明らかにする。これらの解析を通じて、RAMAがロプトリータンパク質の輸送に関わる作用機序の解明を目指す。
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