2019 Fiscal Year Annual Research Report
腸内細菌科におけるmRNAの3'末端を介したRNA制御ネットワークの解析
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19H03464
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
宮腰 昌利 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (60755809)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 転写後調節 / small RNA / 3´UTR / サルモネラ / 大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セントラルドグマにおいて単にタンパク質の鋳型と考えられてきたmRNAは、転写後レベルの制御を受けるだけでなく、他のmRNAを制御することが明かされつつある。腸内細菌科細菌で見出されたmRNAの3´UTRから生成するsmall RNA (sRNA) は、従来型のsRNAと同様に遺伝子発現を調節する機能を持つ新しいタイプの制御因子である。mRNAの3´UTRから派生するsRNAは少なくとも大腸菌やサルモネラにおいて30種類以上存在するが、未だ数例しかその機能は実証されていない。本研究ではmRNAの3´UTRから派生するsRNAの機能を体系的に解析し、原核生物mRNAの3’UTRを介した制御ネットワークを明らかにすることを目的とする。さらに、3´UTRにおける変異の蓄積によってRNA制御ネットワークがどのように腸内細菌科の中で進化してきたのかを実験的に解明する。
腸内細菌科細菌の比較ゲノム解析によってサルモネラHfqが結合する複数の制御性3´UTRを抽出し、3´UTRの過剰発現によるトランスクリプトーム変化の解析を通してそれぞれの標的mRNAを同定した。本年度は、制御性3´UTRと標的mRNAが実際に塩基対を形成して遺伝子発現を制御するか検証するため、制御性3’UTRとその標的mRNAのGFP翻訳融合体を発現するプラスミドを作成し、大腸菌のGFP蛍光強度の変動を蛍光マイクロプレートリーダーで定量解析した。さらに、様々な培養条件において、サルモネラと大腸菌の3´UTR変異株が野生株と比較してFLAGタグを付加した標的mRNAの発現量が変化することをウェスタンブロットで検出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は、Hfqと結合する3´UTRの標的RNAをin silicoの塩基配列解析で予測し、サルモネラにおけるmRNAの3´UTRの機能について逐次実験的な検証を行った。サルモネラ由来の複数のmRNAの3´UTRをpBADプロモーター下流にクローニングし、サルモネラにおいて10分間転写誘導した際のトランスクリプトームの変化を解析し、それぞれの機能を推定することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
サルモネラの代謝と病原性発現に重要なグルタミン合成酵素遺伝子glnAの3´UTRに着目して機能解析を進める。また、引き続き細菌の代謝や病原性に重要な他のmRNAの3´UTRから派生するsRNAの機能を体系的に解析する。
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