2021 Fiscal Year Annual Research Report

アレナウイルス遺伝子間配列の翻訳における役割の解明とウイルスベクターへの展開

Research Project

Project/Area Number	19H03477
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	岩崎正治大阪大学, 微生物病研究所, 特任准教授(常勤) (90820788)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	翻訳制御 / アレナウイルス / 遺伝子発現 / 非翻訳領域 / ウイルスベクター / マイナス鎖RNAウイルス
Outline of Annual Research Achievements	アレナウイルスのmRNA（vmRNA）は5′末端にcap構造を持つが、3′末端はポリA付加を受けない特徴がある。蛍光レポーター遺伝子（ZsGreen）のOFRをリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）mRNA由来の5′-UTR（cap構造有り）及び3′-UTR（ポリA付加なし）で挟んだvmRNA様mRNA（vlmRNA）をin vitro合成し、導入した細胞内のZsGreen蛍光強度を測定することで、IGRに由来するvmRNAの3′-UTRによる翻訳制御を効率よく解析するレポーターシステムを構築してきた。これまでに、このレポーターシステムを用いた解析で、翻訳効率の高いLCMVヌクレオプロテイン（NP）mRNAの3′-UTRのORF直下のごく狭い領域が形成する小さなステムループ構造がウイルスタンパク質非依存的に翻訳を促進することを明らかにしてきた。vlmRNAに結合する宿主タンパク質を免疫沈降法により回収し、沈降物に含まれるタンパク質をウェスタンブロッティング法で解析したところ、poly(A)-binding protein（PABP）は検出されなかった。さらにsiRNAを用いてPABPをノックダウンしてもvlmRNAの翻訳効率に変化がなかったことから、vmRNAの翻訳はPABP非依存的であることが明らかになった。質量分析で同定した、vlmRNAに結合するいくつかの宿主タンパク質についてCRISPR-Cas9法を用いて遺伝子ノックアウト（KO）細胞を作製した。しかし、いずれのKO細胞でもLCMVの増殖が減弱することはなかった。したがって、これらの宿主タンパク質はvmRNAの翻訳制御には関与していないと考えられた。現在は同定した他のvlmRNA結合宿主タンパク質の解析に取り組むとともに、vlmRNAの免疫沈降の方法についてさらなる検討を行っている。
Research Progress Status	令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和3年度が最終年度であるため、記入しない。