2019 Fiscal Year Annual Research Report
全胸腺ストロマ細胞の分子理解にもとづくT細胞分化機構の解明
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19H03485
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
新田 剛 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (30373343)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 胸腺 / T細胞 / 線維芽細胞 / TCR / 自己免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、胸腺微小環境を構成する全ストロマ細胞サブセットを網羅的に同定し、その機能を理解することをめざす。特に、線維芽細胞サブセットが髄質微小環境の空間配置を司るオーガナイザーとして機能し、T細胞レパトア選択と自己寛容に重要な役割を果たすという仮説を検証する
①マウスの胸腺に酵素処理を施して細胞を解離させ、フローサイトメーターを用いて、胸腺上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、周皮細胞を単離し、RNA-seq解析によるトランスクリプトーム解析を行った。また、独自の細胞分画調製法を用いて、皮膜と髄質を構成する線維芽細胞サブセットを単離し、トランスクリプトームデータを得た。髄質線維芽細胞は、リンパ節の細網線維芽細胞（FRC）と似ているものの、ケモカインや細胞外プロテアーゼを含む独自の遺伝子発現パターンを有することが明らかとなった。
②髄質線維芽細胞に高発現するLymphotoxin beta receptor (LTbR) についてfloxマウスを作製し、Twist2Cre系統との交配によって線維芽細胞特異的CKOマウスを作製した。LTbR CKOマウスでは、髄質線維芽細胞数が減少し、機能遺伝子の発現が著しく低下した。また、LTbR CKOマウスでは、複数の末梢臓器に対する自己抗体産生とリンパ球浸潤がみられた。T細胞レパトア選択への影響を調べるため、LTbR CKOマウスをホストとしてTCRbレトロジェニックマウスを作製し、TCRa鎖のNGS解析を行った。LTbR CKOマウスでは、野生型マウスにはみられないTCRをもつT細胞が検出され、胸腺における負の選択が阻害されていることが示唆された。
③Fate-mapマウスを用いて、皮質と髄質の線維芽細胞サブセットがいずれも間葉系幹細胞に由来すること、および胸腺上皮からの分化転換はほとんど認められないことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画の通り、胸腺を構成する全ストロマ細胞の単離に成功し、トランスクリプトーム解析データを得た。特に、皮膜と髄質を構成する線維芽細胞サブセットを単離し特徴づけることができた。昨年公開されたシングルセルデータ（Bornstein et al, Nature 2018）を用いて独自解析し、我々のデータと彼らのデータに整合性があることを確認した。ヒト胸腺についても同様の線維芽細胞サブセットが存在することを見出し、さらなる解析を進めている。
また、LTbRシグナルが髄質線維芽細胞の機能成熟に重要な役割を担うことを明らかにした。LTbR CKOマウスを用いてTCRレパトア解析を実施し、髄質線維芽細胞がT細胞レパトア選択に寄与することを明らかにした。LTbRシグナルが髄質線維芽細胞における自己抗原の発現を制御する可能性について、検討を進めている。
以上、初年度の計画通りの成果を得ることができた。TCRレパトア解析など、一部の実験については２年度目の計画を前倒して実施し、データを得ることができた。候補機能分子のKOマウスやCre KIマウスの作製など、計画通りには進んでいない項目もある。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の解析から、皮膜と髄質の線維芽細胞はさらに複数のサブセットに分けられ、異なる機能を担うことが示唆された。また、皮質上皮細胞についても、皮膜直下や皮質深部に異なるサブセットが存在することが示唆された。これらの実体を捉え細胞集団の全容を理解するため、シングルセルRNAseq解析を計画している。並行して、マーカーを用いて単離した細胞のバルクRNAseq解析も行い、シングルセル解析の解像度不足を補強する。
LTbR CKOマウスについては、自己免疫病態を引き起こすメカニズムを明らかにする。髄質線維芽細胞に発現するタンパク質が、負の選択を誘導する自己抗原として機能する可能性を検証する。また、髄質線維芽細胞が髄質上皮細胞や樹状細胞と相互作用する可能性についても検討する必要がある。
髄質線維芽細胞特異的に発現する遺伝子の下流にCreをKIしたマウスを作製し、floxed-stop-DTRマウスとの交配によって、DTAを投与することで髄質線維芽細胞を特異的に消失させるマウスを作製する。胸腺サイズ、胸腺上皮細胞の分化、T細胞の分化と自己寛容を精査し、髄質線維芽細胞が胸腺髄質形成のオーガナイザーとして機能するとの仮説を検証する。
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