H3K27脱メチル化とシグナル伝達を連結する長鎖ncRNAによるがん細胞運命制御

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03501
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 長鎖ノンコーディングRNA / ヒストン脱メチル化

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞運命決定と運命転換後の状態の維持には、それを指示するシグナル伝達機構とエピジェネティックな機構の連結が必須であるが、不明な点が多い。我々はlncRNAががん細胞の運命転換シグナルの伝達機構とエピジェネティックな機構をつなぐキープレイヤーであると考えている。これまでの研究でTGFβで誘導され上皮間葉転換(EMT)に関与する新規長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）としてELIT-1を見出した。さらにELIT-1はSmad3と特異的に結合し、TGFβシグナルの伝達を正に制御していることを見出した。本研究では、ELIT-1がSmad3と結合するだけでなく、H3K27脱メチル化酵素(KDM6Aor 6B)などのヒストン脱メチル化酵素とも結合して、EMTにおけるシグナル伝達転写因子とH3K27脱メチル化酵素をリンクするlncRNAであるかの検証の研究をしている。また、この役割を担うELIT-1以外のlncRNAの網羅的同定と分子機能の解明を目指している。
ヒストン脱メチル化酵素と結合するlncRNAsの網羅的解析(RIP-Seq解析)にあたり、まずその条件検討を行った。FLAG-KDM6B 発現プラスミドをA549細胞にトランスフェクトし、ライセートを抽出、FLAGタグ抗体およびコントロール抗体を用いて免疫沈降を行った。ウエスタンブロットにより、FLAG-KDM6Bの沈降が確認された。さらに、免疫沈降物中にELIT-1が共沈していることをRT-qPCRで確認でき、KDM6BとELIT-1の結合が証明された。この結果より、ヒストン脱メチル化酵素と結合するlncRNAsの次世代シークエンサーによる網羅的解析に適したサンプル取得条件が構築できたと考えている。一方で内因性のKDM6A/BのRIP-Seq解析には現在まだ問題点があり、条件検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究実績の概要に示したように、RIP-Seq解析における内因性のKDM6A/Bの免疫沈降条件には現在まだ問題点があり、種々の抗体を検討したり、固定の条件の検討を行っており、多少進捗が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

新たな抗体の導入などで、内因性のKDM6A あるいは KDM6Bに結合するRIP-Seq解析の条件設定を解決する予定である。その条件に基づき、過剰発現系及び内因性のKDM6A あるいは KDM6Bに結合するRIP-Seq解析を同時に行い、KDM6A あるいは KDM6Bに結合するlncRNAを網羅的に解析し、RIP-RTqPCRで確認する。最終候補lncRNAをsiRNAでノックダウンして、H3K27me3-ChIP-Seqを行い、ノックダウンによるH3K27me3の変動を解析することにより、目的のlncRNAか否かを検証する。