Understanding of defective developmental gene regulation responsible for motor neuron degeneration

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03545
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 佐橋 健太郎 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (90710103)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 勝野 雅央 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (50402566) ; 井口 洋平 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (80790659)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 脊髄性筋萎縮症 / 運動ニューロン変性

Outline of Annual Research Achievements

脊髄性筋萎縮症(SMA)はSMNタンパク質の欠乏により、下位運動ニューロン死を伴う骨格筋萎縮をきたす乳児死亡最多の遺伝性疾患であり、常染色体劣性遺伝遺伝形式をとる。SMNタンパク質はユビキタスに発現し、全ての細胞の生存に、特に胎生期に不可欠であり、その発現かつ需要度が発達期で高いことが分かっている。SMNはmRNA前駆体スプライシング、ヒストンmRNA代謝に関わるsnRNPの会合に加えRNA軸索輸送を担っており、SMAでは発達障害の関与およびRNA病態が唱えられてきているが、SMNタンパク質の不足の結果による、下位運動ニューロン脆弱性の基盤となる早期病態は解明されていない。ノンコーディングRNA(ncRNA)は翻訳されないが生理機能を有するRNAであり、遺伝子発現の制御機能を有し、神経発生、分化に関わる。ゲノムDNAの90%以上は転写される一方で、mRNAは全RNAの2%にも満たなく、多くのncRNAによるmRNA発現調節が注目されている。そこでSMA病態に関し、新たにncRNAを介するRNAネットワーク異常を起因とする場合も含め、胎生遺伝子の制御異常による発症機構の検討が重要であると考えた。本研究ではSMAモデルマウスとその胎仔運動ニューロン、患者iPS細胞由来運動ニューロンのmRNAおよびncRNA(特にmiRNA)の網羅的解析を通じて細胞変性の発端の機序を明らかするとともに、ニューロン変性過程のRNA変化という知見について患者生体試料などを用いて検証し、疾患バイオマーカーの開発と新規治療標的分子の追求につなげていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

下位運動ニューロンの発達早期での遺伝子発現破綻に起因する病態可能性の探索に、SMAモデルマウス胎仔下位運動ニューロンのncRNAを含めたRNAの発現、スプライシングの網羅的解析を行い、中心的な病態関連RNA分子を同定し、またRNAインタラクトーム(ネットワーク)解析を通じ、RNA介在性遺伝子発現制御の異常からの病態解明を目指した。はじめに胎生期13日目のSMAモデルマウス胎仔より下位運動ニューロンを高純度に回収し、得られたニューロンのRNAシークエンスによるmRNA発現およびスプライシング解析を進めた。胎仔毎のプロファイリング獲得に成功し、前者の解析が完了している(SMAおよび同胞コントロール、各4匹)。予想に反し、SMA において有意な発現変化のあるタンパク質コード遺伝子は10程度しかみられなかったが、脊髄肢節運動ニューロンに特異的に発現し、同ニューロンの発生および分化に重要なA遺伝子の発現低下が見出された。単離下位運動ニューロンを用いてのウエスタンブロットおよびqRT-PCRによりA遺伝子産物の発現低下を確認し、胎仔脊髄の免疫染色により運動ニューロンのサブタイプ特異的な発現低下を確認している。また下位運動ニューロンの初代培養系ではSMAにおいて特徴的な軸索変性がみられ、同部はオートファジー関連マーカー陽性が判明している。本オートファジー異常所見は野生型マウス胎仔下位運動ニューロンの内因性Smn1あるいはA遺伝子のノックダウン系においても再現されていた。さらにA遺伝子の強制発現による、軸索変性および、カスパーゼ活性により評価されるアポトーシスの抑制が見出され、SMA運動ニューロンにおける細胞自律的な、SMN欠乏下流の発達障害機序を示唆する結果が得られており、実験手法の有効性が確認されている。

Strategy for Future Research Activity

これまでに得られている研究成果、知見により、SMA運動ニューロン病態形成において重要と考えられるA遺伝子に注目し、今後その機能障害を発端とする神経変性機構を明らかにする方策をとる。はじめに運動ニューロンの初代培養系でA遺伝子に対するRNAノックダウン、過剰発現により、A遺伝子産物パスウェイを含めた神経発生/分化やシナプス発生関連遺伝子の発現の動態、ミトコンドリア機能、細胞周期の解析、細胞微細形態、スパイン形成の観察を行う。同時にA遺伝子によるSMA病態抑制効果について検証を行う。可能であればSMAアストロサイトや大脳皮質ニューロンなど他細胞種の初代培養系を利用し、A遺伝子関連の運動ニューロン病態の特異性を検討する。続いて、A遺伝子発現異常の再現性を、患者iPS細胞由来運動ニューロンにおいての確認を計画しているが、同ニューロンがA遺伝子発現運動ニューロンサブタイプの発達期形質を有するのかを解析する必要がある。可能であれば、エレクトロポレーションなどにより、A遺伝子コンストラクトのSMAマウス胎仔への早期神経管内投与を行い、個体における運動ニューロン変性に対するレスキュー効果を検証し、SMAにおける細胞特異的神経病態の理解につなげていく。単離SMAマウス胎仔運動ニューロンを用いてのRNAプロファイリングに関しては、さらにRNAシークエンスによるmRNAスプライシング解析と、ncRNAの関連性についてのmiRNAアレイ解析を進める。候補miRNA、その標的mRNAについて、続く患者iPS細胞由来運動ニューロンモデルを用いた検証研究に展開していく。また培養上清中のエクソソームを分離し、それに含まれる病態関連RNA発現も解析し、これらのバイオマーカーとしての利用可能性を検討する。