2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of preventive therapy for Alzheimer's disease by modification in expressional levels of the risk genes
| Project/Area Number |
19H03546
|
|---|
| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
西村 正樹 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 教授 (40322739)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 将希 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 特任助教 (00823890)
渡邊 直希 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 助教 (60769339)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | アルツハイマー病 / リスク遺伝子 / アミロイドβ / 遺伝子発現制御 / 先制医療 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Alzheimer病の疾患修飾薬開発においては、認知症発症前の予防的介入が必須とされるなか、新たな治療戦略の開拓が不可欠である。本課題では初期病態を引き起こすリスク分子に注目している。これまでに孤発性症例との連鎖が判明している遺伝子座の多くは非コード領域の単塩基置換であり、遺伝子発現レベルの変化を介して発症リスクに影響すると推測されている。これは遺伝子発現制御への介入によって発症リスクを軽減できる可能性を示唆する。本症の分子病態は、Aβペプチドの脳内蓄積によりトリガーされることから、脳内Aβ蓄積に対するリスクを軽減することは根源的な病態抑止につながると期待される。本研究では、脳Aβ蓄積のリスク遺伝子のうちAPP, ABCA7, FAM3Cを対象として、遺伝子転写制御（促進ないし抑制）をゲノム改変を伴わずに可能にするCRISPR/dCas9システムの構築と臨床応用を目指した最適化を進める。
令和元年度は、CRISPR/dCas9システムの構築を目的に、まずFAM3C遺伝子の内因性転写制御機構の解析を進めた。ヒトFAM3C遺伝子の転写開始点上流領域ゲノムDNAを入手し、プロモーター活性を示す領域を検索して20bp領域にまで絞り込んだ。次に、このプロモーター塩基配列情報を基に認識配列を検索し、4つの転写因子候補を同定した。また、CRISPR/dCas9システムの構築に向けて、転写開始点上流転写調節領域をターゲットとしたsgRNAを複数設計した。現在、候補sgRNAを培養細胞で試し、最も効率の高いsgRNAの選択を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(Ⅰ)標的遺伝子：(a)APP：Aβの前駆体であり、アミノ酸置換やコピー数増加がAlzheimer病発症の原因になる。発現抑制を目指す。(b)ABCA7：単塩基多型による発現低下が発症とリンクするため、転写活性化を目指す。(c)FAM3C/ILEI：代表者らがAβ産生抑制活性を見出した分子であり、転写活性化を目指す。
(Ⅱ)標的遺伝子の転写調節メカニズム解析：(a)プロモーター解析：令和元年度は、FAM3C遺伝子の転写開始点上流領域ゲノムDNAを用い、レポーターアッセイにてプロモーター活性を示す領域を20bpまで絞り込んだ。APPとABCA7についても、同様の解析を進める。 (b)転写因子候補の同定：FAM3C遺伝子のプロモーター領域配列を基に転写因子認識配列を検索し、４つの内在性転写因子を同定した。
(Ⅲ)培養細胞を用いたCRISPR/dCas9システムの構築：(a)Single guide RNA (sgRNA)の設計：上記の解析結果をもとに、FAM3C遺伝子について、転写開始点上流転写調節領域をターゲットとしたsgRNAを複数設計した。これら候補sgRNAを培養細胞で試し、最も効率の高いsgRNAを選択するべく、解析を進めている。 (b)dCas9の検討：FAM3C遺伝子をターゲットとしたCRISPR/dCas9システムにおいて、コードDNAサイズが比較的小さいCas9オーソログを用いて効率を比較検討している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
(Ⅱ)標的遺伝子の転写調節メカニズム解析：(a)プロモーター解析：令和元年度、FAM3C遺伝子の転写開始点上流領域DNAを用い、レポーターアッセイにてプロモーター活性を示す領域を絞り込んだ。今後、APPとABCA7についても、同様の解析を進める。 (b)転写因子候補の同定：FAM3C遺伝子のプロモーター領域配列を基に転写因子候補を同定した。各候補について、神経系培養細胞での強制発現や発現抑制による転写効率の変化を評価する。さらに、脳組織由来の核抽出タンパク質を用いたプルダウンアッセイやゲルシフトアッセイにより、内因性転写調節因子であることを確認する。 (c)神経系培養細胞を用い、FAM3Cプロモーター領域をゲノム編集技術で欠損させて、内在性FAM3C発現への寄与度を確認する。
(Ⅲ)培養細胞を用いたCRISPR/dCas9システムの構築：(a) sgRNAの設計：APPとABCA7についても、転写開始点上流転写調節領域をターゲットとしたsgRNAを設計する。候補sgRNAを培養細胞で試し、効率の高いsgRNAを選択する。 (b) dCas9の検討： CRISPR/dCas9システムにおいて、コードDNAサイズが比較的小さいCas9オーソログでの効率を検討する。
（Ⅳ）実験動物個体を用いた最適化と検証：脳へのdCas9-sgRNAのデリバリーは、非分裂細胞に比較的長期に亘る効果が得られることと免疫原性の回避などの安全性から、まずAAV9ベクターを試みる。DNA容量が制限されることへの対策として、dCas9の選択、デュアルAAVシステム、ベクターフリーシステムなどを試みる。以上から最適化されたCRISPR/dCas9システムとベクター系を用い、投与法（脳実質内、髄腔内、末梢など）の検討も合わせ、Alzheimer病モデルマウスでの試験に進める。
|
-
-
[Journal Article] Generation of transgenic cynomolgus monkeys overexpressing the gene for amyloid-β precursor protein2020
Author(s)
Seita Y, Morimura T, Watanabe N, Iwatani C, Tsuchiya H, Nakamura S, Suzuki T, Yanagisawa D, Tsukiyama T, Nakaya M, Okamura E, Muto M, Ema M, Nishimura M, Tooyama I.
-
Journal Title
Journal of Alzheimer's Disease
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
-
[Journal Article] Decrease in p3-Alcβ37 and p3-Alcβ40, products of Alcadein β generated by γ-secretase cleavages, in aged monkeys and Alzheimer’s disease patients2019
Author(s)
Hata S, Omori C, Kimura A, Saito H, Kimura N, Gupta V, Pedrini F, Hone E, Chatterjee P, Taddei K, Kasuga K, Ikeuchi T, Waragai M, Nishimura M, Hu A, Nakaya T, Meijer L, Maeda M, Yamamoto T, Master CL, Rowe C, Ames D, Yamamoto K, Martins RN, Gandy S, Suzuki T.
-
Journal Title
Alzheimer's & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions
Volume: 5
Pages: 740-750
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
-
-
-
