2019 Fiscal Year Annual Research Report
Genetic-environmental interaction for congenital cardiovascular disease
| Project/Area Number |
19H03622
|
|---|
| Research Institution | Keio University |
|---|
Principal Investigator |
山岸 敬幸 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (40255500)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土橋 隆俊 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (10286528)
古道 一樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10338105)
内田 敬子 慶應義塾大学, 保健管理センター(日吉), 講師 (50286522)
湯浅 慎介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90398628)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 発生・分化 / 遺伝子 / 発現制御 / シグナル伝達 / 循環器・高血圧 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、先天性心臓流出路異常のモデルマウスとして、22q11.2欠失症候群の責任遺伝子であるTBX1の発現が低下した遺伝子改変マウスを解析し、遺伝子および環境因子がどのように心臓流出路異常の表現型に関与するかを解明することを目的としている。Tbx1発現低下胎仔の総動脈幹症が、妊娠母マウスに葉酸を投与した場合に軽症化する細胞機序の解明として、心臓神経堤由来間葉系細胞におけるapoptosisの亢進が葉酸投与により抑制されることを確認した。さらに、この分子機序の解明として、胎生9.5日のマウス心臓神経堤細胞を単離培養し、葉酸を添加し、遺伝子発現とDNAメチル化パターンの変化について網羅的に解析した。
ヒトiPS細胞を用いた実験系では、心臓流出路発生を担う心臓前駆細胞の制御機構を明らかにすることを目的とする。TBX1およびTBX20が発現する二次心臓領域由来心臓前駆細胞を、ヒトiPS細胞から分化誘導・純化するために、二次心臓領域特異的マーカーであるISL1遺伝子の制御下に発現する蛍光蛋白遺伝子を、ゲノム編集技術を用いてヒトiPS細胞に導入・選別した。いくつかの細胞で、心筋分化誘導後、蛍光発現が認められた。
さらに、複数の遺伝子変異の遺伝的相互作用が先天性心疾患の表現型におよぼす影響と分子機序を解明することを目的として、TBX1・TBX20複合遺伝子変異マウスの心疾患表現型の解析を開始した。TBX20とTBX1はT-boxファミリーの中で特に構造・起源が近く、どちらも二次心臓領域細胞に発現している。各ヘテロ変異マウスの交配によりTbx1+/-Tbx20+/-マウスを得た。Tbx1+/-Tbx20+/-マウスは生存・交配可能だったが、Tbx+/-と同様か、やや重症の心臓流出路・大血管異常が一部の胎仔に認められた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) Tbx1発現低下マウスの総動脈幹症の発症細胞機序として、心臓神経堤由来間葉系細胞のapoptosisの亢進が関与し、葉酸投与によりそれが抑制されることが再現性をもって確認された。
2) Tbx1発現低下マウスの総動脈幹症の発症分子機序として、胎生9.5日のマウス心臓神経堤細胞を単離培養し、葉酸を添加し、遺伝子発現パターンとDNAメチル化パターンについての網羅的解析結果が得られた。
3) 二次心臓領域特異的マーカーであるISL1遺伝子の制御下に発現する蛍光蛋白遺伝子を、ゲノム編集技術を用いてヒトiPS細胞に導入・選別した。
4) TBX1・TBX20複合遺伝子変異マウスの心疾患表現型の解析を開始し、Tbx1+/-Tbx20+/-マウスを得た。Tbx1+/-Tbx20+/-マウスは生存・交配可能だったが、Tbx+/-と同様か、やや重症の心臓流出路・大血管異常が一部の胎仔に認めた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Tbx1発現低下マウスの総動脈幹症の発症分子機序の解明として、胎生9.5日のマウス心臓神経堤細胞を単離培養し、葉酸を添加し、遺伝子発現パターンとDNAメチル化パターンについての網羅的解析結果が得られたので、今後、その中で発現変化量が大きく、かつ葉酸投与により発現量が野生型に近似するように回復する候補遺伝子を複数選別し、再現性を確認する。候補遺伝子の選別の際には、心臓神経堤細胞、二次心臓領域細胞、心臓流出路発生に関与すると考えられている遺伝子群、ならびに、新規機能が想定される遺伝子群に注目して解析する。
ヒトiPS細胞を用いた実験系では、二次心臓領域特異的マーカーであるISL1遺伝子の制御下に発現する蛍光蛋白遺伝子を、ゲノム編集技術を用いてiPS細胞に導入・選別したので、遺伝子導入後も多分化能が安定したiPS細胞株を複数株樹立する。この樹立したヒトiPS細胞株を用いて、TBX1の開始コドンをCRISPR/Cas9で非相同末端結合によって破壊することによりTBX1の発現を障害したヒトiPS細胞を作製し、その心筋分化誘導過程における、分化効率、増殖能、トランスクリプトーム、プロテオームを解析し、ヒトとマウスの異同を明らかにすると同時に、TBX1の発現を障害したヒトiPS細胞株の表現型の異常に関与するシグナルを同定する。
Tbx1およびTbx20遺伝子改変マウスを交配し、Tbx20/Tbx1ダブル変異マウス胎仔の心血管表現型を解析する実験系では、実体顕微鏡による全体像の観察、心臓組織切片の作製、分子マーカー（一次心臓領域マーカー：Tbx5, Nkx2.5など、二次心臓領域マーカー：Fgf8, Islet-1など、心臓神経堤細胞マーカー：Pax3, AP2など）を用いた検討により、心疾患表現型と分子機序を詳細に解明する。
|
