2020 Fiscal Year Annual Research Report
体細胞ゲノム編集創薬の実現による家族性高コレステロール血症の根本的治療
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19H03656
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
山本 剛史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (80636994)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斯波 真理子 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 非常勤研究員 (70271575)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR/Cas / アシアロ糖タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はゲノム編集システムのin vivo送達を可能にする技術を開発することを目的としている。本年度は、昨年度構築したASGPRに対するリガンドをCRISPR/Casシステムへ導入するための最適な方法を検討した。具体的には、リガンドの導入に用いるケミストリーを検討し、最適条件にてin vivo実験に供するための大量供給のためのマテリアル合成を実施した。パイロットスケールで合成した当該コンストラクトについて、イメージング実験を行うために蛍光分子のラベリング条件の検討も実施した。得られた成果物について、in vivoイメージングならびにex vivoイメージングにより体内動態解析を行なった。結果、リガンド搭載型では非搭載型と比較し、優位に臓器移行量が増加していることを見出したことから、リガンドの共役によりCRISPR/Casシステムが複合体として標的の肝臓に１時間以内に集積することが明らかとなった。他方、当該コンストラクトのゲノム編集活性を評価するために、試験管内での標的切断活性並びに培養細胞を用いたゲノム編集効率を評価した。これらの結果、リガンド搭載型においても非搭載型と同程度のヌクレアーゼ活性とゲノム編集活性を見出すことができた。細胞内動態についても評価を進め、細胞質内へ効率よく送達するための技術の開発を進めた。また、レポーターミニジーン及びBase Editorのベクター構築についても合わせて検討を行なった。
以上の結果は、リガンド搭載型のCRISPR/Casシステムは首尾良く狙いの臓器に移行し、もしその後、効率よく細胞質内に侵入することができれば遺伝子編集が可能であることを示すものである。このことは、本研究の主目的である世界初のRNPを用いたin vivoでのゲノム編集を可能にする大きな一歩であると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通りin vivo実験に進むためのリガンド導入型コンストラクトの供給を達成し、in vivoでの体内動態解析へと進むことができた。この結果、当初見込んでいた以上の体内動態改善効果が見出された。他方、試験管内での標的切断活性並びに培養細胞レベルでのゲノム編集活性について体内動態をサポートする有意義な結果を得た。総じて、in vivoゲノム編集の実現に大きな一歩となる結果を得たと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）昨年度構築したASGPRを持つCRISPR/Casコンストラクトに関して、リガンドの効果・性能を評価するためのin vitro/in vivoイメージング等によるより詳細な動態解析を進める。動態改善技術についても模索する。
２）in vitro試験管内での標的切断活性評価に加え、培養細胞を用いた評価系を用いることにより細胞内導入効率やゲノム編集効率を詳細に評価し、設計の改良を行う。
３）コンストラクトの脂質異常症治療効果を評価するために、病態モデルマウスに対して投与し、ゲノム編集効率の評価及び血清資質への影響を精査する。
４）Base editorについて遺伝子編集効率の向上を目指すとともに、患者由来細胞やサロゲートモデルにて治療効果を検討する。
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