2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19H03662
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
内藤 篤彦 東邦大学, 医学部, 教授 (10588891)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | miniSOG / 光遺伝学 / DNA損傷 / DNA損傷応答 / LINE-1 / SINE-1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、DNA損傷を時間的・空間的・定量的に制御する実験系を構築することで、DNA損傷に対する心筋細胞と非心筋細胞のDNA損傷応答機構の違いを明らかにし、心筋細胞特有のDNA損傷応答機構を規定するメカニズムを解明することである。2019年度にはDNA損傷を時間的・空間的・定量的に制御する実験系として、励起光を照射することでROSを産生するminiSOGタンパク質と核タンパクであるH2BやLaminB1の融合タンパクを発現するコンストラクトを作成して細胞に導入した。293T細胞を用いてコンストラクトがワークすることを確認した後、正常細胞株IMR90およびBJ-1にエレクトロポレーション法で遺伝子導入を行った。遺伝子導入効率は30%程度であり、導入した遺伝子の発現も確認できた。
薬剤セレクションで安定細胞株を得ようと試みたが、全ての細胞が死滅してしまった。293T細胞を用いて様々な検討を加えたところ、miniSOG遺伝子産物には「リーク」が存在する、すなわち光をあてなくてもROSを産生することで細胞にストレスを与えることが明らかになった。また、ゲノム全域にわたって散在するレトロトランスポゾンの一種であるLINE-1に特異的なgRNAと誘導性のCas9およびCas9 nickaseを細胞に導入することを試みたが、ゲノムを移動した際に生じる変異からLINE-1を標的としたgRNAのデザインが難しいことがわかり、別のトランスポゾンSINE-1を標的とした実験系を構築することとした。様々な程度のDNA損傷に対する心筋細胞と非心筋細胞のDNA損傷応答機構の違いを明らかにするため、Topoisomerase IおよびIIに対する阻害薬を用いてDNA損傷を定量的に加える実験系を構築したところ、DNA損傷後のDNA損傷応答シグナルの活性化に細胞間で違いが存在することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
miniSOGを用いた研究は、過去の論文を再現することができず頓挫しているが、DNA損傷応答シグナルの細胞間での違いに関する重要なデータを得ており、研究は概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
光遺伝学の実験手法への信頼性が失われたため、トランスポゾン配列を標的としてdCas9/Cas9でDNA損傷を加える実験系の構築を推進する。非特異的なDNA損傷を引き起こす過酸化水素等の物質ではなく、作用機序が明らかな化合物を用いた実験や特定のDNA損傷修復を担う遺伝子の阻害を通じてmechanisticにDNA損傷を加え、心筋細胞と非心筋細胞のDNA損傷に対する応答の違いを評価する。
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