2019 Fiscal Year Annual Research Report

染色体分配因子によるエピゲノム制御機構の解明と新規白血病治療標的の同定

Research Project

Project/Area Number	19H03690
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	星居孝之千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (20464042)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	金田篤志千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (10313024) 荒木喜美熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ヒストンメチル化酵素 / 白血病 / 転写制御 / 細胞分裂
Outline of Annual Research Achievements	急性骨髄性白血病の新たな治療標的として同定したH3K4メチル化酵素SETD1Aに着目し、質量分析法により新たに同定した新規SETD1A結合蛋白質について解析を実施した。まず質量分析法により得られた結果を検証するため、SETD1Aをベイトにした免疫沈降実験を行い、SETD1Aと新規結合蛋白が結合することを確認した。さらに様々なサイズのSETD1Aの蛋白断片を用いて結合解析を行い、新規結合蛋白が我々の同定したSETD1Aの機能ドメイン内に結合することを明らかにした。Doxycyclin誘導型shRNAを活用したin vitroでの白血病発症における機能解析を実施し、新規結合蛋白が白血病細胞の生存に必須の分子であることを明らかにした。さらに新規結合蛋白によって制御される遺伝子群を同定することを目的とし、RNA-seq法によりshRNA発現細胞の網羅的な遺伝子発現解析を実施した。既に解析済みであるSETD1A欠損細胞の遺伝子発現プロファイルと比較解析することにより、共通して変動する遺伝子群を同定した。また、ChIP-seq法により、新規結合蛋白のクロマチン上の局在を解析し、その転写開始点上に認められたシグナルから、核内において転写制御に関わることを明らかにした。新規結合蛋白のドメイン変異体を樹立し、機能回復実験により、結合蛋白の役割を解析した。新規結合蛋白と既知のSETD1A結合蛋白との複合体形成について、免疫沈降法により詳細な解析を行った。さらに、SETD1Aの新規結合蛋白と蛍光蛋白との融合蛋白を細胞に発現させて、細胞染色法による細胞内局在解析やタイムラプス解析から細胞分裂に依存した動態を解析し、細胞周期に依存した役割を見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 機能解析において、モデルとする急性骨髄性細胞株でノックダウンにより明らかな増殖抑制効果が確認されており、新規の治療標的として有望であることを示す結果であることから今後の研究の進展が期待できる。機能解析と同時に、次世代シーケンス技術を活用したデータ取得や解析も順調に進行している。新規蛋白のChIP-seq解析については、プレリミナリーなデータは取得出来ているが、シグナル強度が弱いことから、データの信頼性を高めるためには検出法を改善する必要がある。ドメイン変異体についても当初計画した変異体の樹立はほぼ完了した。タイムラプス解析など、新規技術の導入も進んでおり、更なる解析の進展が期待出来る。
Strategy for Future Research Activity	In vitroでの機能解析が進展したことから、in vivoの白血病モデルマウスを活用し、より生理的な条件下での機能解析を実施する。また複数のヒト白血病細胞株や白血病以外のがん細胞株により機能を比較し、特異性についても検証する。新規蛋白のChIP-seq解析については、新しい蛋白タグを導入し、蛋白-クロマチン複合体をより効率的に濃縮出来る方法を開発する計画である。また新規結合蛋白が染色体分配に関わることから、SETD1Aが直接的に染色体分配に関わる可能性についても検証し、ヒストンメチル化酵素の新しい機能についても追求する。