2019 Fiscal Year Annual Research Report
新規血管再生マクロファージのメカニズム解析を通じた新規血管再生治療の開発
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19H03816
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
田中 里佳 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (70509827)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 茂夫 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (40747797) [Withdrawn]
水野 博司 順天堂大学, 医学部, 教授 (80343606)
西貝 燕 順天堂大学, 医学部, 博士研究員 (80614007)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 血管再生 / マクロファージ / 糖尿病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、難治性潰瘍患者の末梢血のM2マクロファージをin vitroで機能強化・細胞増幅する技術を開発した。興味深いことにその培養から得られる細胞中に血管再生の治療効果と正の相関がある特徴的なマクロファージを見出した。本研究では、申請者が独自に発見したこの細胞の細胞学的特性と血管再生機構を解明する。現行の細胞移植治療以上の効果をもたらす新規治療法の開発革新的血管再生治療法に向けた基盤研究を行う。平成31年度は、ボランティアの健常人と糖尿病患者末梢血から単核球を分離し、独自で開発した生体外培養法を用いてReMa（Regenerative Macrophage）を作成した。ReMa細胞の細胞表面抗原（CDX）を同定し、本細胞の細胞生物学的特性を調べた。FACSにより細胞表面抗原本細胞を単離回収し、本細胞の分離に成功した。In vitroにて細胞生物学的特性をTube formation assay, EPC culture assay, Colony forming assay, Adhesion Assay, Chemotaxis assay, qPCRを用いて解析した結果、CDX陽性細胞であるReMa細胞は高い血管再生、血管新生、内皮細胞遊走能、血管形成能を有していることが明らかになった。以上の結果よりReMa細胞は「血管再生マクロファージ」としての細胞生物学的特性があり、CDXの発現を失った細胞はその性質が喪失すること、糖尿病患者マクロファージには本細胞の割合が多いほど血管再生能が保たれることを証明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成31年度は、ボランティアの健常人と糖尿病患者末梢血から単核球を分離し、独自で開発した生体外培養法を用いてFACSにより細胞表面抗原本細胞を単離回収してReMa細胞のマーカーを同定することを計画し、計画通りマーカーを同定することに成功した。また、ReMa細胞の分離技術も確立することができ、In vitroにてReMa細胞は「血管再生マクロファージ」としての細胞生物学的特性があることを証明することに成功した。これらはすべて平成31年度に実施する計画を実施終了している。これらの成果は令和2年度に計画しているIn Vivoにおける解析へと進める基盤となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和２年度は、ボランティアの健常人と糖尿病患者末梢血から単核球を独自の培地で培養しReMa細胞とNon-ReMa細胞を作成し、非糖尿病ヌードマウス下肢虚血モデルに移植する。移植後6時間、1日、3日、7日、14日にドップラー検査における下肢血流改善効果、免疫組織学的解析による血管新生（CD31染色）、炎症（iNos, Arg染色）、抗線維化効果(Azan染色)を実施し、ReMaによる細胞移植効果を検証する。次に、レプチンの影響を受けないI型糖尿病ヌードマウス下肢虚血モデルにReMa細胞を移植し、糖尿病環境下におけるReMa細胞の血流改善、血管新生効果を上記同様に検証するし、糖尿病マウスにおいても細胞治療効果を維持できるかを確認する。さらに、組織内におけるReMa細胞の直接的血管再生機序を解明するため、蛍光タンパク質の遺伝子を搭載したレンチウイルスをReMa細胞へ導入し、ヌードマウス下肢虚血に移植する。血管再生の過程における血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、pericyteとの局在、移動や分化について、CD31（血管）、血管内皮前駆細胞(CD34)などのマーカーとの共免疫染色により追跡し、ReMa細胞の血管再生に及ぼす影響を解明する。次いで、ReMa細胞から分泌される血管新生に関与する主なサイトカインを同定するためReMa細胞のCondition Medium（CM）を作成し、サイトカインアレーにてCM中の血管新生関連蛋白を同定する。同定されたサイトカインの作用を確認するため、ReMa細胞を用いた血管形成試験にサイトカイン特異的な阻害剤を添加して効果を確認する。本年度中に結果は得られないが、ReMa細胞のRNASeqによる網羅的遺伝子解析を開始する。予算は本実験を実施するための消耗品に使用する。
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