2019 Fiscal Year Annual Research Report
Therapeutic strategies against inflammation and bone loss associated with Del-1 production
| Project/Area Number |
19H03828
|
|---|
| Research Institution | Niigata University |
|---|
Principal Investigator |
前川 知樹 新潟大学, 医歯学系, 研究教授 (50625168)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土門 久哲 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00594350)
砂塚 敏明 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (30226592)
寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | DEL-1 / 骨免疫学 / 破骨細胞 / 抗炎症 / 免疫調節 / エリスロマイシン / リウマチ関節炎 / マクロライド改変体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
歯周炎は慢性炎症に伴う歯周組織の破壊を特徴とし，心疾患や関節リウマチ，糖尿病など様々な全身疾患への憎悪的な波及が示唆されている．歯周病原細菌は，歯周組織への過度な好中球の浸潤を促し，炎症性サイトカインや骨吸収促進因子の産生を引き起こすことで破骨細胞を活性化し，骨破壊を誘導する．これまでに血管内皮細胞の産生するDel-1が，①好中球の走化性を低下させ過度な炎症を抑制すること，②破骨細胞の分化および骨吸収活性を抑制すること，および③Del-1は破骨細胞自身からも産生され，破骨細胞分化を負にフィードバックすることを明らかにしてきた．そこで本研究では，Del-1の発現制御機構，およびDel-1による炎症制御・破骨細胞分化・骨吸収活性の抑制メカニズムを統合的に解析する．さらに，同Del-1解析結果に基づき，歯周炎を含む炎症性骨破壊疾患に対する分子標的薬の研究開発を，ノーベル賞受賞で創薬実績のある分担チームと行う．
令和元年度は，Del-1の骨破壊制御機構における新規経路の解明を目指した．Del-1KOマウスと野生型マウスから単離した破骨前駆細胞を，RANKL存在下において培養したのち，次世代型シークエンサーを用いたRNA-seqにより骨代謝関連遺伝子の転写活性を網羅的に比較解析し，Del-1作用機序の解析した．続いて破骨細胞活性化因子に対するDel-1阻害作用の解明のために，炎症性サイトカイン（IL-17，TNF，歯周炎組織で上昇を認める報告がある分子）または骨代謝に関連する分子とDel-1を破骨前駆細胞に作用させ，分化と骨吸収活性を測定した．またDel-1と破骨細胞分化および活性阻害対象分子の結合能を分子間相互作用装置を用いて明らかにした．さらに，良好な結果が得られた経路に関して，同刺激を加えたのちにChip-SeqによってDel-1の作用経路を上流から下流へ統合的に解析した．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
令和元年度は当初予定されていたDEL-1の機能解析の他に，令和２年度で行う予定であった分子生物学的な解析も加えることが可能となった．特にDEL-1の機能解析においては，歯周炎のみならず，同じ粘膜炎である肺炎を対象とした研究も遂行することが可能となり，マウスモデルを用いたDEL-1解析を用いることで，良質な結果が得られた．さらに，DEL-1誘導の新規受容体および経路を見出すことができた．また，DEL-1誘導の候補としてマクロライド系抗菌薬がDEL-1を誘導する機能を持つことも明らかにすることができた．同結果は，すでに国際雑誌へ投稿が完了している．つづいて，エリスロマイシンから抗菌作用を除去した耐性菌を生じない改変体のセレクションも進んでおり，免疫調節作用をもつ新しい薬剤の開発への可能性がある．さらに，DEL-1が生体において減少していることおよび間葉系幹細胞への作用効果が認められたことから，予定を繰り上げて新しい計画も試行する予定である．
以上のことから，当初の計画以上に進展していると判断した．
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和２年度は，新型コロナウイルスへの対応を加味しながら，実行可能かつ予定されている研究を迅速に遂行する．まず初めに，血管内皮細胞と破骨細胞に強力にDEL-1を誘導するマクロライド改変体の選定をおこなう．マクロライド改変体は研究分担者により構築されたものを使用する．DEL-1の主な産生細胞である血管内皮細胞および破骨前駆細胞を用いた研究代表者独自のDEL-1測定ハイスループットアッセイにて，マクロライド誘導体ライブラリーを作用させた後，ELISAにて培養上清中のDEL-1濃度を測定し，候補マクロライド改変体を選別する．当初予定されていたマクロライド改変体が機能する受容体の同定は，すでに令和元年度におこなった研究によりGHSRが同定された．そこで血管内皮細胞および破骨前駆細胞においてGHSRノックアウト株を作製し，マクロライド改変体の作用解析を行う．また同受容体欠損マウスを作成し，生体での動態を確認する．マクロライド改変体によるDEL-1誘導メカニズムの下流シグナルの同定には，最下流シグナルのDEL-1プロモーター領域のC/EBPβ結合部位を対象としたChipアッセイにより，マクロライド改変体の作用機序を解明する．
バックアッププランとして，選定したマクロライド改変体に，十分なDel-1の誘導活性がない場合，研究分担者が有するライブラリーから，さらに選択幅を広げてスクリーニングを行う．または，研究代表者が見出したDel-1誘導能を有する化合物群（デヒドロエピアンドステロンおよびリゾルビン）の構造解析を行い，それらに類似する化合物を有機合成することで，新規の候補薬剤の作製を試みる．マクロライド改変体が機能する受容体や下流シグナルが新規同定できない場合，申請者が蓄積してきた既報のDEL-1調節シグナル候補経路を中心に検証を行う．
|
