2019 Fiscal Year Annual Research Report
基底膜構成分子の誘導制御による低侵襲角化歯肉獲得療法の確立
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19H03841
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
前川 賢治 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (20304313)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
窪木 拓男 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00225195)
冨田 秀太 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (10372111)
大橋 俊孝 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (50194262)
大野 充昭 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (60613156)
ハラ エミリオ・サトシ 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (40779443)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 角化歯肉 / 基底膜 / 再生療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
基底膜直下に存在する角化歯肉由来間葉細胞と非角化歯肉由来間葉細胞の遺伝子発現の相違を明らかにすることで，上皮細胞の角化に関わっている間葉細胞からのシグナル分子を抽出することが可能であると考える。そこで，令和元年度は，レーザーマイクロダイセクション法とRNA-Seq を組み合わせた候補因子の抽出を目的に，以下の実験を実施してきた。
間葉組織は，筋肉や脂肪など様々な組織を含むことから，マクロレベルで口蓋粘膜から間葉組織を採取すると，様々な組織を含んでしまう。基底膜直下の間葉組織の遺伝子発現解析を正確にするには，特異的に組織を採取することが可能なレーザーマイクロダイセクション法を用いる必要がある。そこで，マウスの口蓋粘膜（角化粘膜）と頬粘膜（非角化粘膜）の凍結組織切片を作製し，サンプルの厚み，固定方法，染色方法，レーザーの強度の調整等，様々な条件検討を行い，本組織において最適な条件を見出した。そして，これらのサンプルからRNAを抽出し，RNA-seqが可能な質の高いRNAが回収できていることを，TapStation (アジレント)にて確認した。
また、in vitroにおいて，角化粘膜の間葉組織に高発現している遺伝子をRNA-seq解析から抽出後，さらなる候補因子の絞り込みをin vitroにて行う予定である。そこで，令和元年度は，ヒト口腔扁平上皮癌由来の口腔粘膜上皮細胞であるTR146と，ヒト口腔粘膜細胞由来線維芽細胞を用いた三次元共培養実験モデルを構築すべく，コラーゲンゲルの種類，濃度や細胞の濃度などの条件検討を行い，正常な口腔粘膜組織に類似したin vitro モデル構築に適正な条件の絞り込みを終えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書に記載していた当該年度の研究計画が実施でき，得られた結果も今後の研究計画を実施する基盤となるデータや手法の確立に繋がったため．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は，回収したRNAからランダムプライマーを用いたSMART-seq stranded kit，もしくはオリゴDTプライマーを用いたSMART-seq v4キットを用いてcDNAライブラリーを作製し，どちらが質の高いcDNAを作製可能か検討する。そして得られた質の高いcDNAライブラリーを用いてRNA-seq解析を行う。また，非角化粘膜と比較し，角化粘膜の間葉組織に高発現する因子を抽出する。
次に，角化関連基底膜分子 (Ⅳ型コラーゲン556, ⅩⅧ型コラーゲン，ラミニン332)のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイベクターをそれぞれ作製し，レポーターアッセイベクターを上皮細胞に遺伝子導入する。抽出された角化粘膜の間葉組織に高発現する因子群のリコンビナントタンパク質で間葉細胞を刺激し，角化関連基底膜分子群の発現調整に関わる候補因子の絞り込みを行う。
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[Presentation] Type XVIII collagen modulates oral mucosal keratinization in adult mice.2020
Author(s)
Nguyen HTT, Ono M, Hara ES, Komori T, Edamatsu M, Yonezawa T, Kimura-Ono A, Maekawa K, Kuboki T, Oohashi T.
Organizer
98th General Session & Exhibition of the IADR 2020.3.21 Washington DC, USA.
Int'l Joint Research
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