2020 Fiscal Year Annual Research Report
基底膜構成分子の誘導制御による低侵襲角化歯肉獲得療法の確立
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19H03841
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
前川 賢治 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (20304313)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大野 充昭 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (60613156)
冨田 秀太 岡山大学, 大学病院, 准教授 (10372111)
大橋 俊孝 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (50194262)
窪木 拓男 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00225195)
ハラ エミリオ・サトシ 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 研究准教授 (40779443)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 角化歯肉 / 基底膜 / 再生療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの我々の研究成果より，基底膜直下に存在する角化歯肉由来間葉細胞と非角化歯肉由来間葉細胞の遺伝子発現の相違を明らかにすることで，上皮細胞の角化に関わっている間葉細胞からのシグナル分子を抽出することが可能であると考える。間葉組織は，筋肉や脂肪など様々な組織を含むことから，マクロレベルで口蓋粘膜から間葉組織を採取すると，様々な組織を含んでしまう。基底膜直下の間葉組織の遺伝子発現解析を正確にするには，特異的に組織を採取することが可能なレーザーマイクロダイセクション法を用いる必要がある。そこで，令和２年度は，レーザーマイクロダイセクション法とRNA-Seq を組み合わせた候補因子の抽出を目的に，以下の実験を実施してきた。まず，マウスの口蓋粘膜(角化粘膜)と頬粘膜(非角化粘膜)の凍結組織切片を作製し，サンプルの厚み，固定方法，染色方法， レーザーの強度の調整等，様々な条件検討を行い，本組織において最適な条件を見出した。 そして，回収したRNAからランダムプライマーを用いたSMART-seq stranded kitを用いてcDNAライブラリーを作製し，Illumina社製のHi-Seqにてシークエンス解析を行った。その結果，非角化粘膜と比較し，角化粘膜の間葉組織に高発現する遺伝子 (2倍以上)が1138抽出され，その中に12の転写因子が含まれていた。今後の計画としては，すでに確立している口腔粘膜を模倣した三次元培養モデルを用いて，抽出された12転写因子を中心に歯肉粘膜の角化に与える影響を検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書に記載していた当該年度の研究計画が実施でき，得られた結果も今後の研究計画を実施する基盤となるデータや手法の確立に繋がったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の計画としては，すでに確立している口腔粘膜を模倣した三次元培養モデルを用いて，抽出された12転写因子を中心に歯肉粘膜の角化に与える影響を検討する予定である。具体的には，候補遺伝子の強制発現ベクターを作製する。または，発現抑制モデルとして，候補遺伝子のsiRNAを購入したうえで間葉細胞に遺伝子導入し，歯肉上皮細胞と三次元培養する。培養7, 14日後に回収し，角化のマーカーであるケラチン1, ケラチン10の免疫染色を行い，歯肉角化関連遺伝子の同定を行う。また，RNA-seq解析にて抽出された遺伝子を用いて，歯肉の角化メカニズムをPathway解析，IPA解析等などのin silico解析にて明らかにする。
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