2020 Fiscal Year Annual Research Report
脂肪由来幹細胞の分化を制御する運動療法の新しい分子機構：細胞内アミノ酸代謝の役割
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19H04010
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
井澤 鉄也 同志社大学, スポーツ健康科学部, 教授 (70147495)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小笠原 準悦 旭川医科大学, 医学部, 講師 (20415110)
加藤 久詞 同志社大学, 研究開発推進機構, 特別研究員 (30780275)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 脂肪由来幹細胞 / 運動トレーニング / 高脂肪食 / ロイシン / Sestrin2 / Girdin / mTOR / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脂肪由来幹細胞（ADSC）は多分化能をもち，新しい脂肪細胞を補充することで脂肪組織を構成する細胞の質や状態（cellularity）を維持する。2019年度研究において，高脂肪食摂取や運動トレーニングに影響されるADSCの脂肪分化能は，L-ロイシンの修飾を受ける可能性が示唆された。本年度は，ADSCの脂肪分化時におけるアミノ酸センサー／アミノ酸輸送体（Sestrin2／LAT1），mTORC1，オートファジー分子に及ぼすL-ロイシンの影響を追求した。
実験動物はWistar系雄ラットを用い，通常食摂取（ND），高脂肪食摂取（HFD），通常食摂取運動トレーニング（ND-TR），および通常食摂取運動トレーニング（HFD-TR）の4群に分けた。9週間の介入後，L-ロイシン含有または不含培地で鼠蹊部脂肪組織および精巣上体脂肪組織のADSCを脂肪細胞に分化させ（鼠蹊部分化脂肪細胞および精巣上体分化脂肪細胞），アミノ酸センサー／アミノ酸輸送体（Sestrin2／LAT1）ならびにこれらの分子に付随して動くタンパク質の発現変化を検討した。鼠蹊部分化脂肪細胞のSestrin2タンパク質発現量は，L-ロイシン添加によってND-TR群で低下した。一方，ND-TR群の精巣上体分化脂肪細胞では，Aktキナーゼの新規タンパク質であるGirdinのタンパク質発現量がL-ロイシンによって増加することが分かった。また，L-ロイシン不含培地における精巣上体分化脂肪細胞のリン酸化mTORC1タンパク質発現量は運動トレーニングで低下する傾向にあったが，L-leucine添加で対照群と同等のレベルにまで回復することが分かった。さらに，ND-TR群およびHFD-TR群のLC3II/LC3I比はL-ロイシン添加により精巣上体分化脂肪細胞で増加し，鼠蹊部分化脂肪細胞では低下することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度の最も大きな当初目的は，脂肪由来幹細胞をL-ロイシン含有または不含培地で脂肪細胞に分化させ，アミノ酸センサー／アミノ酸輸送体（Sestrin2／LAT1など），ならびにこれらの分子に付随して動くタンパク質の発現変化を明らかにすることであった。この当初目的は概ね順調に進み， Sestrin2やLAT1，下流分子のmTOR（mechanistic target of raparnycin）系，およびオートファジー関連因子のタンパク質発現のL-ロイシンに対する反応性に及ぼす運動トレーニングや高脂肪食摂取の影響について明らかにすることができた。一方，コロナの影響で大学の研究施設使用が制限されたため，タンパク質リン酸化反応（Phos-Tag法によるリン酸化の度合いや発現変化）は詳細な検討には及ばなかった。この点においてのみ，やや進展が遅れ，次年度にさらなる追及を行う予定である。
しかしながら， ES細胞などの幹細胞の分化にMAPK（Mitogen-activated Protein Kinase）や細胞接着・細胞骨格因子が関与することから，脂肪由来幹細胞から分化させた脂肪細胞においてMAPKや細胞接着・細胞骨格因子のmRNAやタンパク質発現を検討したところ，運動トレーニングによって ERK（Extracellular Signal-regulated Kinase）やインテグリンのタンパク質発現量が有意に増加することが分かった。この結果は，次年度以降の研究を進展させる大きなヒントを与えてくれた。
以上のことから，研究全体としては概ね順調に推移したと判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究をさらに深化させるため，アミノ酸センサー／アミノ酸輸送体（Sestrin2／LAT1など）ならびにこれらの分子と連関するタンパク質（細胞骨格因子Girdinなど）やmTOR複合体の動きをアミノ酸によって誘導し，脂肪由来幹細胞（ADSC）のアミノ酸をシグナルとする分化調節ネットワークで働く分子の振る舞いに及ぼす運動トレーニングや高脂肪食摂取の影響を明確にする予定である。
まず，前年度に同定した分子群（Sestrin2／LAT1，mTOR，Girdinなど）について共免疫沈降法によってタンパク質間相互作用を解析する予定である。さらに，オートファジーはオートファジー検出蛍光試薬を用いて確認するとともに，オートファジーマーカータンパク質群の発現変化をウエスタンブロット法によって追求する。加えて，Phos-tag法によってリン酸化タンパク質をリン酸化レベルに応じて分離し，様々な種類のタンパク質の網羅的リン酸化解析を考えている。
また，ADSCの脂肪細分化時の細胞内シグナル伝達経路の全体像を把握するため，RNA-Sequence解析による転写産物の網羅的探索を行い，パスウェイ解析やGO解析を組み合わせ，上記分子に関わる転写産物と新規転写産物の同定を実施する予定である。
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Research Products
(9 results)
