2019 Fiscal Year Annual Research Report
運動ストレス応答にカルパインの酵素活性はなぜ必要なのか？
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19H04014
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
尾嶋 孝一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 上級研究員 (60415544)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | カルパイン / 骨格筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では骨格筋特異的に発現するタンパク質分解酵素であるカルパイン3に着目し、カルパイン3がどのようにして運動ストレスを感知し、どのような基質を切断し、切断した基質に対してどのような機能を付与することで運動ストレスから防御するのか、という点を解明することを目的とする。培養細胞系における運動刺激モデルとして培養骨格筋細胞に電気刺激を負荷する系を構築し、カルパイン3の活性状態をイムノブロットにより検討した。その結果、負荷する電気刺激のパターン、強さ、負荷時間と、カルパイン3の活性化パターンには関連があるような傾向を得た。しかし、効率的にカルパイン3を活性化させるための電気刺激のパターンを決定するまでには至っていない。次年度はこの点を詰める必要がある。さらに、カルパイン3が自己消化したときに生じる断片を特異的に認識する抗体をウサギで作製し、抗血清をアフィニティー精製した。作製した抗体はイムノブロットにおいてはカルパイン3の検出はできるものの、反応性に乏しく、免疫沈降、間接蛍光抗体法等の実験には使うことができなかった。従って、次年度に抗体の抗原部位を変えることで再度抗体の作製を行う予定である。また、カルパイン3の活性を骨格筋細胞内でモニターするプローブの作製も行った。培養骨格筋細胞にカルシウムイオノフォア処理することで細胞内カルシウム濃度を上昇させ、強制的にカルパイン3を活性化させた。その状態において培養骨格筋細胞内でカルパイン3の活性状態を検出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養骨格筋細胞に電気刺激を負荷するin vitro運動負荷モデルを構築する際に、培養筋細胞に負荷する電気刺激のパターン、強さおよび刺激時間の組み合わせが数多くある。しかし、電気刺激装置にかけられる培養細胞のサンプル数が限られているため、適切な刺激パターンを得るために実験回数を多くする必要があり、データを得るために予定よりも時間がかかった。また、作製した抗体の反応性が弱かったため、当初の計画通りに研究を進めることができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度うまくいかなかった抗体作製を抗原となる部位を変えることで再度行う。培養細胞運動刺激モデルの負荷パターンの最適化を行う。さらに、運動負荷モデルを使い、培養骨格筋細胞内のカルパイン３を活性化させ、カルパイン３の酵素学的な基質の探索を行う。対照実験としては酵素活性を持たないカルパイン３を野生型カルパイン３の代わりに発現するマウスから調製した骨格筋細胞を用いて行う。野生型マウスと活性を持たないカルパイン３の遺伝子改変マウスの差に着目して、運動刺激特異的に切断される基質を見出す。
コロナウイルスにより在宅勤務命令が発せられたが、在宅勤務では実験をすることができないこと、現時点では在宅勤務の期間がどの程度続くのかわからないので、計画通りに実験ができるかどうか不安である。
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Research Products
(2 results)
