運動ストレス応答にカルパインの酵素活性はなぜ必要なのか？

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H04014
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 尾嶋 孝一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 上級研究員 (60415544)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 骨格筋 / カルパイン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では骨格筋に発現するカルパインファミリーに着目し、どのようにして運動ストレスを感知し、どのような基質を切断し、切断した基質に対してどのような機能を付与することで運動ストレスから防御するのか、という点を解明することを目的とする。これまでに、培養細胞系における運動刺激モデルである培養骨格筋細胞に電気刺激を負荷する系において、カルパイン3の活性化をモニターし、負荷する電気刺激のパターン、強さ、負荷時間と、カルパイン３自己消化断片の出現パターンを評価した。本年度はカルパイン３以外にもカルパイン１および２が骨格筋細胞には発現しているため、運動刺激モデルにおいてこれらのカルパインが酵素学的に活性化するのか否かを精査した。その結果、カルパイン１の自己消化断片が微弱ながら検出できたこと、およびカルパインの代表的な基質であるスペクトリンの断片が運動刺激モデルを負荷した培養骨格筋細胞にて検出できたことから、カルパイン１も運動刺激モデルにおいて活性化していると示唆された。マウスに運動負荷をかける予備実験を行った結果、野生型マウスと比較して酵素活性不全のカルパイン３を野生型カルパイン３の代わりに発現するマウスのトレッドミルでの走行距離が短い傾向にあった。今後この結果の再現性をとるためにマウスの匹数を増やして行う。カルパイン3の基質となる筋原線維性タンパク質を見出したため、アミノ酸シークエンサーにより切断部位のアミノ酸残基の同定を試みた。サンプル量が十分に取れないせいか同定できなかった。今後、量が少なくとも可能な質量分析計において測定する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

時間がかかったわりにうまくいかなかった実験（カルパインの基質切断部位の同定、カルパイン３以外のカルパインの動態解析）があったため、なかなか計画通りには進まなかった。しかし、面白い結果が集積しつつあるので、落ち着いて研究を進めていくつもりである。

Strategy for Future Research Activity

一昨年度にカルパイン３の基質となる筋原線維性タンパク質を見出していたが、切断部位でのアミノ酸残基の同定がうまくいかなかったので再度行う。また、マウス運動負荷試験の再現性をとるともに、運動負荷後の骨格筋細胞内でのカルパイン1-3およびその基質の動態を解析する。予想していなかったことであるが、カルパイン３自体が他のタンパク質分解酵素によって切断を受けることを示唆するデータが得られたため再現性を確認し、骨格筋細胞内での生理的な意義を明らかにする。昨年は海外での学会発表の機会が新型コロナウイルス蔓延のため失われたが、今後は機会があれば発表する予定である。In vitroおよびin vivoのデータをうまく組み合わせて論文発表を目指す。