DNA2本鎖切断修復制御の中核となるユビキチン依存的DNA損傷応答の解明

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H04269
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 中田 慎一郎 大阪大学, 高等共創研究院, 教授 (70548528)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宇井 彩子 東北大学, 加齢医学研究所, 准教授 (00469967)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: DNA損傷応答 / ユビキチン

Outline of Annual Research Achievements

ＲＮＦ８・ＲＮＦ１６８依存的なＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）応答における分子機構の詳細を研究するために、ＤＳＢシグナリングをＤＮＡ損傷非依存的に解析するための手法を開発した。
ゲノム中に９６個連続したＴＲＥ（Ｔｅｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を組み込んだＵ２ＯＳ細胞に対し、ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＲＮＦ８融合遺伝子を発現させ、ＲＮＦ８をＴＲＥｘ９６に局在（テザリング）させ、局所のユビキチン化依存的な応答を検証するシステムである。まず、一過性発現によりシステムが想定通りに機能することを確認の上、薬剤誘導性にＲＮＦ８を核移行させるシステムに発展させ、最終的には、発現ベクターをゲノムに組み込むという順でシステムの開発を進めることとした。
当初、ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＲＮＦ８の発現により、ｍＣｈｅｒｒｙのｆｏｃｉ（ＴＲＥｘ９６に局在したＲＮＦ８）と共局在する結合型ユビキチン（ＦＫ２抗体により染色される）のｆｏｃｉ、およびＲＮＦ１６８のｆｏｃｉ形成が蛍光免疫染色により確認された。一方、ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙのみの発現では、ｍＣｈｅｒｒｙのｆｏｃｉと共局在する結合型ユビキチンやＲＮＦ１６８のｆｏｃｉ形成は非常に弱く、実験系が予定通り機能していると予想された。しかし、ＲＮＦ８の核内への誘導を薬剤誘導性（Ｔａｍ誘導性）にデザインを変更した際、ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ　ＲＮＦ８がＴａｍ非依存的に核内にｆｏｃｉ形成してしまい、また、ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙのみでもＴａｍ非依存性にｍＣｈｅｒｒｙが核移行してしまうことが判明した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

上記の問題に対し、核移行シグナルとなりうる配列を除去する等の改良を加えたものの、依然として、ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙのみでもＴａｍ非依存性にｍＣｈｅｒｒｙが核移行してしまう状況が改善されなかった。このため、ＲＮＦ８をＴＲＥｘ９６に誘導する実験を精密に実施することが不可能となった。

Strategy for Future Research Activity

ＴｅｔＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターの再構築を行う。具体的には、ＴｅｔＲ，　ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＮＦ８の順を変更する。これにより、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＲＮＦ８をＴａｍ誘導性にＴＲＥｘ９６に局在させ、ユビキチン化依存シグナルの分子機構を解析する。引き続き、シグナリングのＡＴＭ依存性・ＭＤＣ１依存性等ににつき解析を行っていく。