DNA鎖のねじれ解消に働く酵素Top2がDNA二重鎖切断修復に果たす役割

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H04271
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 矢野 憲一 熊本大学, 産業ナノマテリアル研究所, 教授 (70311230)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: DNA修復 / DNA二重鎖切断 / DNA損傷 / ライブイメージング / DNAトポイソメラーゼ2

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、DNA鎖の過剰なねじれを解消するのに働く酵素であるDNAトポイソメラーゼII (Top2)が、最も重篤なDNA損傷であるDNA二重鎖切断 (DSB) が生じた際にどのように応答し、その修復に関与するかについて解析を行っている。ヒトが持つ二つのTop2 (Top2A, Top2B) のうち、Top2BはCTCFやcohesinの多数のサブユニットと相互作用して染色体上の特定部位に存在していることが報告されている。こういった相互作用因子の中にはTop2Bと同様にDSB部位に集積するものもある。そこで本年度はまず、こういったTop2B相互作用因子がTop2BのDSB集積に必要であるかどうかを調べた。Top2B相互作用因子に対するsiRNAをHeLa細胞へ一過的に導入してRNA干渉による機能阻害を行った上で、EGFP-Top2Bを発現させた。蛍光顕微鏡観察下でUVパルスレーザー照射を行ってDSBを生成し、その部位へのEGFP-Top2Bの集積を観察した。その結果、CTCFやcohesinサブユニットの機能阻害はEGFP-Top2BのDSB集積には影響しないことが判明した。これらの因子を介して染色体上に結合しているTop2Bとは異なる核内プールのTop2BがDSB部位へと集まる可能性が推察された。
続いて、Top2の酵素サイクルの各ステップの阻害剤が、Top2のDSB集積に与える影響を検討した。HeLa細胞中でEGFP-Top2A, -Top2Bを一過的に発現させ、各種阻害剤を作用させた後にFRAP解析や、UVパルスレーザー照射によるDSB生成を行った。その結果、ICRF-187やICRF-193といったTop2阻害剤は、Top2の核内流動性を著しく低下させてDSB集積を阻害するが、Top2ポイズンであるetoposide処理では核内流動性の低下はわずかであり、DSB集積への影響も小さかった。Aclarubicin処理した細胞ではEGFP-Top2の核内流動性は著しく低下し、DSB集積も阻害された。Aclarubicinの作用機序はTop2とDNAの相互作用の阻害とされているが、生きた細胞内でのAclarubicinのTop2への作用は、これとは異なる可能性が考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度と本年度の研究により、DSBの感知や修復に重要とされるタンパク質や、既知のTop2相互作用因子が、Top2のDSB集積に必要ではないことを明らかにしてきた。Top2がDSBを認識して集積するメカニズムや、DSB修復にどのように関与するかを理解するためには、さらなる解析が必要である。

Strategy for Future Research Activity

Top2A、Top2Bの各々について、DSB集積のメカニズムを明らかにする取り組みを継続する。またTop2阻害剤がTop2A, Top2Bの核内挙動とDSB集積に与える影響についても解析を継続する。最近、Top2Bの一アミノ酸置換がヒトの遺伝病の原因となっている例が報告されているが、こういった一アミノ酸置換を持つTop2BのDNA損傷応答についても検討を行う。