2019 Fiscal Year Annual Research Report
クラスターDNA損傷の構造変化および修復機構の解明
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19H04273
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
倉岡 功 福岡大学, 理学部, 教授 (60335396)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塩井 成留実 (青木成留実) 福岡大学, 理学部, 助教 (50510187)
竹立 新人 福岡大学, 理学部, 助教 (20846505)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | クラスターDNA損傷 / DNA修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線により生じるDNA損傷は、ゲノムDNAの非常に狭い空間的に複数個密集することがある。このように生じたDNA損傷の「かたまり」（クラスターDNA損傷）は、一般環境中に生じるDNA損傷と比べて、その損傷の密集性から非常に修復され難いと予測されている。また、このクラスターDNA損傷は、最終的にDNA鎖の切断を導き、遺伝子の欠失や挿入さらには転座、そして発がんに関与することが考えられている。
本研究では、ヒトにおける放射線生物影響の新しい理解を生み出すことを目的としている。具体的には、修復系が明らかになっている既知のDNA損傷の２つをDNA分子の特異的位置に挿入することで、クラスターDNA損傷を模倣し、細胞内でのクラスターDNA損傷の構造変化および修復機構を生化学的および細胞学的に解析する。
しかしながら，正確にクラスターDNA損傷を特定することは難しい。何故ならば、塩基配列および損傷の数は多種多様であるからである。そこで本実験では、いくつかの損傷パターンを仮定して研究を進める。放射線により生じるクラスターDNA損傷の主な原因は活性酸素であり、8-オキソグアニンとサイクロプリンの損傷を生じる。はじめに、BER修復によって修復される8-オキソグアニン損傷およびNER修復によって修復されるサイクロプリン損傷をプラスミド上の局所的配置したDNA修復基質を作製する。また，これらのプラスミドは生化学的解析用と細胞学的解析用のものと２種類を作製する。具体的には、生化学的解析用はニッケース部位を有する改変プラスミドを用いて損傷オリゴヌクレオチドを挿入する、細胞学的解析用のDNA修復基質は蛍光タンパク質のバイシストロニック発現ベクターを用いて、その遺伝子上にDNA損傷を配置することでDNA修復をモニターできるように設計した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定であったプラスミドの設計および製作は進んでいる。概要に記載したように放射線により生じるクラスターDNA損傷の主な原因は活性酸素であり、8-オキソグアニンとサイクロプリンの損傷を生じるので，はじめに、塩基除去修復（BER）によって修復される8-オキソグアニン損傷およびヌクレオチド除去修復（NER)によって修復されるサイクロプリン損傷をプラスミド上の局所的配置したDNA修復基質を設計し，ほぼ作製することができた。このプラスミドは生化学的解析用であるので，現在細胞学的解析用のものを設計し，作製しているところである。
具体的には、生化学的解析用はニッケース部位を有する改変プラスミドを用いて損傷オリゴヌクレオチドを挿入している、一方，細胞学的解析用のDNA修復基質は蛍光タンパク質のバイシストロニック発現ベクターを用いて、その遺伝子上にDNA損傷を配置することでDNA修復をモニターできるように設計する予定であったが，こちらのベクターは損傷が修復された時に，核にモニター遺伝子産物が移行するように再設計し，作製中である。
加えて生化学的に解析するために，ヒト細胞抽出液を作製した。また，その抽出液の修復能力を評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
生化学的解析用プラスミドDNA修復基質およびヒト細胞抽出液を用いて、２本鎖DNA切断機構の解析を行う。これらの基質によってDNA切断が観察された場合、クラスターDNA損傷基質は、アガロースゲル上で特異的なDNA切断が観察できると予測される。
修復反応に関して、クラスターDNA損傷がDNA修復切断されているのか、サザンブロット法により解析する。さらにDNA修復合成（BERおよびNER）に関しては、放射標識することによって修復合成産物を変性ウレアゲル電気泳動で解析する。加えて、上記並行し、インビトロ転写実験により転写産物が損傷により影響を受けるかを解析する。また、両方のDNA鎖に損傷が存在する基質に関しては、両方のDNA鎖が修復のテンプレートになりうるので修復基質に変異が導入されていないかをシークエンス解析により明らかにする。
ヒト細胞抽出液は、8-オキソグアニン修復因子OGG1およびNER修復因子XPAを欠損した細胞をゲノム編集技術CRISPR/CAS9システムによって樹立し、それらの細胞から抽出液を作製し、それぞれのタンパク質を加えることによって、その修復機構を解析する。8-オキソグアニンおよびサイクロブリンを同時に有するクラスターDNA損傷基質においては、どちらの損傷が先に修復されるか、これらの修復機構のクロストークを担う因子がないかを探索する予定である。
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